本文關鍵詞：B型流感病毒反向遺傳平臺的構建及其應用

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【摘要】：研究目的：構建B型流感病毒反向遺傳技術平臺,并利用該反向遺傳系統(tǒng)構建B型流感重配病毒,研究影響病毒生長特性的因素。研究方法：利用A型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)pHW2000載體為骨架,構建B型流感病毒反向遺傳平臺,即構建包含病毒各節(jié)段的8個重組質粒,將重組質�；旌虾蠊厕D染293T及MDCK混合細胞,培養(yǎng)后以雞胚或細胞傳代拯救B型流感病毒重配病毒；根據(jù)病毒基因組序列特點,挑選2013-2015年間我國分離的B型野生型及系間重配流感病毒作為研究對象,利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose,簡稱TCID50)方法計算病毒液含有的顆粒數(shù),稀釋病毒液至顆粒數(shù)相同后再感染MDCK細胞,收集各時間點的病毒培養(yǎng)液,進行病毒滴定,以培養(yǎng)時間點為橫坐標,各時間點下病毒滴度為縱坐標,獲得病毒生長曲線；檢測病毒神經(jīng)氨酸酶活性,并以酶活動力學常數(shù)Km值表示；嘗試利用構建的B型流感反向遺傳系統(tǒng),拯救不同組合的重配B型流感病毒,測定重配病毒的生長特性,分析影響病毒生長特性的因素。主要結果：成功構建了B型流感病毒反向遺傳技術平臺并加以應用；發(fā)現(xiàn)2013-2015年我國分離的野生型病毒及系間重配病毒的生長曲線走勢相似,在感染后的0-48h病毒滴度不斷上升,可維持至72h后病毒滴度逐漸下降,病毒的Km值分布于16-40之間；利用該B型流感病毒技術平臺構建了不同片段替換方式的重配病毒,對重配病毒進行生長曲線檢測,結果顯示單一替換基因片段對病毒的生長特性無顯著影響,而三種多片段組合替換方式均可導致重配病毒生長特性降低。結論：利用A型流感病毒pHW2000為載體的反向遺傳技術同樣適用于B型流感病毒,并可利用該系統(tǒng)構建B型重配流感病毒以驗證影響病毒生長特性的主要因素；多基因協(xié)同作用影響B(tài)型流感病毒的生長特性。
【關鍵詞】：B型流感病毒 生長特性 系間重配 反向遺傳
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.13
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 構建B型流感病毒反向遺傳技術平臺12-32
• 1 材料與耗材12-15
• 1.1 細胞12
• 1.2 雞胚12
• 1.3 病毒12
• 1.4 主要試劑與配制方法12-13
• 1.5 主要耗材13-14
• 1.6 主要儀器14-15
• 2 方法15-27
• 2.1 病毒核酸提取15
• 2.2 目的片段擴增實驗15-17
• 2.3 瓊脂糖凝膠電泳17
• 2.4 產(chǎn)物回收實驗17-19
• 2.5 BsmBI限制性內切酶酶切體系19
• 2.6 載體連接實驗19-20
• 2.7 細菌轉化實驗20-22
• 2.8 質粒提取22-23
• 2.9 轉染實驗23-27
• 3 結果27-29
• 3.1 目的片段獲得及基因序列分析27-28
• 3.2 質粒構建28-29
• 3.3 拯救病毒及重配病毒鑒定29
• 4 討論29-32
• 第二部分 利用反向遺傳平臺構建重配病毒并對重配病毒進行生長特性研究32-51
• 1 材料與耗材32-33
• 1.1 細胞32
• 1.2 雞胚32
• 1.3 病毒32
• 1.4 主要試劑與配制方法32-33
• 1.5 主要耗材33
• 1.6 主要儀器33
• 2 方法33-39
• 2.1 細胞復蘇與傳代33
• 2.2 病毒細胞傳代33
• 2.3 病毒雞胚傳代方法33-34
• 2.4 神經(jīng)氨酸酶活性檢測實驗34-36
• 2.5 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID_(50))實驗36-38
• 2.6 病毒生長曲線實驗38-39
• 2.7 拯救重配病毒39
• 3 結果39-48
• 3.1 病毒進化分析39-40
• 3.2 病毒生長曲線測定40-43
• 3.3 神經(jīng)氨酸酶活性檢測結果43-44
• 3.4 系間重配病毒的片段替換44-48
• 4 討論48-51
• 第三部分 結論51-52
• 參考文獻52-54
• 綜述54-60
• 參考文獻58-60
• 致謝60-62
• 附錄 已發(fā)表文章全文62-66

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本文編號：701358