本文關(guān)鍵詞：14型肺炎球菌莢膜多糖純化工藝的建立與優(yōu)化

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【摘要】：肺炎球菌(Streptococcus Pneumoniae,SP),簡稱肺炎球菌,是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌,是導(dǎo)致全球人類發(fā)病和死亡的主要致病菌之一,主要引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎以及敗血癥等疾病。目前已有利用其保護性抗原—肺炎球菌莢膜多糖(PnPS)制備的23價肺炎球菌莢膜多糖疫苗和7價、13價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗上市,以防御肺炎球菌對成人和嬰幼兒造成的感染。論文以14型肺炎球菌為實驗材料,采用常規(guī)細菌學(xué)檢定方法對其進行了篩選,挑出生物學(xué)特性典型、莢膜結(jié)構(gòu)完整豐厚、與14型分型診斷血清凝集作用較強的31601-5菌株建立發(fā)酵的工作種子庫;以細菌生長菌密度、莢膜多糖產(chǎn)率等指標為依據(jù),通過細菌發(fā)酵罐培養(yǎng),對其適宜培養(yǎng)基成分、菌液接種量以及通氣方式等條件進行篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明,以添加了天冬氨酸和谷氨酰胺的氨基酸培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在培養(yǎng)溫度為37℃,菌種接種量為10%、培養(yǎng)基pH值7.2、CO2 2 L/min及壓縮空氣3 L/min共同通氣培養(yǎng)的條件下,14型肺炎球菌生長較好,菌密度達13.068,莢膜多糖產(chǎn)率可達到0.4 g/L。其次,對14型肺炎球菌培養(yǎng)液的裂解工藝進行了優(yōu)化和驗證,通過觀察裂解濃度、裂解時間、裂解溫度對裂解效果的影響,最終確立了14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)液的裂解工藝為:細菌光密度OD600值≤12時,細菌培養(yǎng)結(jié)束后,于培養(yǎng)液中加入脫氧膽酸鈉,使其終濃度為0.12%,置于18~22℃環(huán)境下靜置12~18h。然后,將裂解液分別用乙醇分級沉淀法和CTAB沉淀法進行純化,并檢測氨基己糖含量、蛋白質(zhì)含量、核酸含量及免疫雙擴散法確定抗原活性,全面評價各種方法的純化效果,結(jié)果表明,乙醇分級沉淀法更適于14型肺炎球菌粗多糖的純化。最后,對裂解液中的粗多糖分別用脫氧膽酸鈉法和苯酚抽提法進行處理后超濾、干燥。收獲凍干后的莢膜多糖,經(jīng)全面分析后,確定14型肺炎球菌粗多糖的去蛋白質(zhì)工藝為脫氧膽酸鈉法。工藝參數(shù)為:加入脫氧膽酸鈉,終濃度0.5%,調(diào)pH至5.0以下,離心取上清液,經(jīng)100Kd膜堆超濾后冷凍干燥收獲液。論文還應(yīng)用響應(yīng)面法對14型肺炎球菌莢膜多糖的超濾工藝進行優(yōu)化。根據(jù)實際操作情況及經(jīng)驗選取跨膜壓力、切向流量和多糖濃度作為自變量,以膜包處理能力作為響應(yīng)值,先進行單因素試驗,考察跨膜壓力、切向流量、多糖濃度對膜包處理能力的影響,并初步確定曲線的拐點和試驗步長,再以單因素試驗為基礎(chǔ),利用Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面優(yōu)化組合,采用Design Expert軟件分析數(shù)據(jù),確定最佳超濾工藝參數(shù)為:跨膜壓力12.8Psi、切向流量66L/h、多糖濃度0.86g/L;最適透析倍數(shù)為5倍。本實驗最終建立了一種穩(wěn)定、可適用于大規(guī)模生產(chǎn)需求的14型肺炎球菌莢膜多糖純化方法。
【關(guān)鍵詞】：肺炎球菌 培養(yǎng) 莢膜 多糖 純化
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.1
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 縮略詞9-10
• 第1章 引言10-14
• 1.1 課題意義及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀綜述10-12
• 1.1.1 肺炎球菌簡介10-11
• 1.1.2 肺炎球菌莢膜多糖疫苗11
• 1.1.3 23價肺炎球菌莢膜多糖疫苗研發(fā)的意義11-12
• 1.2 課題研究目標和研究內(nèi)容12-14
• 1.2.1 現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的缺陷12
• 1.2.2 課題研究目標12
• 1.2.3 課題研究內(nèi)容12-14
• 第2章 14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝的建立14-24
• 2.1 材料與方法14-16
• 2.1.1 材料和儀器14-15
• 2.1.2 方法15-16
• 2.2 結(jié)果與分析16-22
• 2.2.1 工作種子株的挑選結(jié)果16
• 2.2.2 14型肺炎球菌培養(yǎng)條件的摸索16-22
• 2.3 討論22-24
• 第3章 14型肺炎球菌發(fā)酵液裂解工藝的建立24-30
• 3.1 材料與方法24-25
• 3.1.1 材料和儀器24
• 3.1.2 方法24-25
• 3.2 結(jié)果與分析25-29
• 3.2.1 鏡檢法25-28
• 3.2.2 培養(yǎng)法28-29
• 3.3 結(jié)論29-30
• 第4章 14型肺炎球菌莢膜多糖粗提工藝的建立30-47
• 4.1 材料與方法30-32
• 4.1.1 材料和儀器30
• 4.1.2 方法30-32
• 4.2 結(jié)果與分析32-45
• 4.2.1 純化預(yù)處理——離心、超濾32-33
• 4.2.2 乙醇分級沉淀法工藝的摸索和建立33-38
• 4.2.3 CTAB沉淀法對14型肺炎球菌莢膜多糖的粗提取38-41
• 4.2.4 兩種方法提取效果的比較41-45
• 4.3 討論45-47
• 第5章 14型肺炎球菌莢膜多糖去蛋白工藝的建立47-53
• 5.1 材料與方法47-48
• 5.1.1 材料和儀器47
• 5.1.2 方法47-48
• 5.2 結(jié)果與分析48-51
• 5.2.1 兩種去除蛋白方法對純化多糖收獲量及組分的影響48
• 5.2.2 兩種去除蛋白方法對純化多糖分子量的影響48-49
• 5.2.3 兩種去除蛋白方法對純化多糖抗原活性的影響49-50
• 5.2.4 兩種去除蛋白方法對純化多糖結(jié)構(gòu)的影響50-51
• 5.3 討論51-53
• 第6章 14型肺炎球菌莢膜多糖超濾、干燥工藝的建立53-62
• 6.1 材料與方法53-54
• 6.1.1 材料和儀器53
• 6.1.2 方法53-54
• 6.2 結(jié)果與分析54-61
• 6.2.1 膜包截留分子量的選擇54
• 6.2.2 單因素試驗結(jié)果54-56
• 6.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗56-59
• 6.2.4 超濾終點的確定59-61
• 6.3 討論61-62
• 結(jié)論62-64
• 參考文獻64-67
• 致謝67-68
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 萬華杰;;肺炎鏈球菌及其疫苗[J];醫(yī)學(xué)信息(上旬刊);2011年07期

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3 斯琴高娃;烏云;田艷飛;;淺析苯酚對環(huán)境的污染[J];內(nèi)蒙古石油化工;2006年12期

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本文編號：630470