本文關鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結合區(qū)蛋白在昆蟲細胞中的重組表達與免疫保護作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)重組表達MERS-Co V S1和RBD蛋白,明確其作為重組疫苗靶抗原的免疫原性和誘導中和抗體的能力;利用制備的S1重組蛋白篩選制備具有中和活性的抗MERS-Co V單克隆抗體。方法:(1)構建含有MERS-Co V S1基因的重組桿狀病毒質粒,轉染SF9細胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒,感染Sf9細胞,收獲感染上清,通過鎳離子親和層析純化獲得S1重組蛋白。利用純化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平;通過假病毒以及活病毒中和試驗檢測血清中抗體的中和活性。同時利用重組表達S1蛋白免疫BALB/c小鼠,將免疫后小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,通過ELISA篩選出陽性克隆,隨后通過多次亞克隆篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株,制備單抗腹水并進行抗體效價測定及亞類鑒定;通過MERS-Co V假病毒及活病毒中和試驗篩選出中和單抗。(2)利用生物信息學方法對MERS-Co V S1基因序列、二級結構、柔性分析;同時對MERS-Co V RBD、MERS-Co V單克隆抗體及MERS-Co V RBD與細胞受體DPP4結合的晶體結構進行分析預測在S1內部具有免疫保護功能區(qū)段355-590aa;針對預測的免疫功能保護區(qū)設計添加foldon序列,構建含有MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd基因的重組桿狀病毒質粒,轉染SF9細胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒進而感染Sf9細胞,收獲感染上清,通過鎳離子親和層析純化獲得RBD、RBDFd重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平;通過假病毒以及活病毒中和試驗檢測血清中抗體的中和活性。結果:(1)獲得了表達MERS-Co V S1蛋白的重組病毒株,并在昆蟲細胞中成功表達和純化了分子量約140k D S1重組蛋白。利用重組表達的S1蛋白免疫小鼠三次,血清S1特異性Ig G抗體滴度可達1:102400;免疫小鼠血清稀釋5120倍后中和百分比仍能達到50%以上,且具有良好的活病毒中和活性。(2)利用重組的MERS-Co V S1蛋白篩選獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細胞株。制備的腹水單抗亞類為6株為Ig G1型,2株為Ig G2a型,2株為Ig M型;10株單抗抗體ELISA效價達到10000以上,并獲得1株單抗對MERS-Co V具有良好的中和活性。(3)獲得了表達MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd蛋白的重組病毒株,在昆蟲細胞中成功表達并純化了分子量約40k D MERS-Co V RBD單體重組蛋白以及分子量約100k D MERS-Co V RBDFd寡聚體蛋白。利用重組表達的RBD單體蛋白免疫小鼠三次,血清MERS-Co V RBD特異性Ig G抗體滴度可達1:6400;免疫小鼠血清稀釋3200倍后中和百分比低于50%,對MERS-Co V假病毒的中和活性較弱。而利用形成寡聚體的RBD蛋白在一次加強免疫后,血清中MERS-Co V RBDFd特異性Ig G抗體滴度可達1:102400;免疫小鼠血清稀釋12800倍后中和百分比仍高于50%。結論:利用昆蟲細胞重組表達的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能夠有效誘導產(chǎn)生高滴度保護性中和抗體,篩選制備出一株具有良好中和活性的MERS-Co V單克隆抗體。重組表達的MERS-Co V RBD單體蛋白免疫原性以及對假病毒中和活性都較弱;利用昆蟲細胞重組表達的MERS-Co V RBDFd寡聚體重組蛋白具有很強的免疫原性,能夠有效誘導產(chǎn)生高滴度中和抗體,對MERS-Co V假病毒以及活病毒都具有很好的中和活性。該研究為發(fā)展一種安全有效的針對MERS-Co V的預防疫苗奠定了堅實基礎。圖35幅,表4個。參考文獻57篇。
【關鍵詞】：MERS病毒 受體結合區(qū) 單克隆抗體
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 符號說明11-12
• 1 前言12-16
• 2.MERS病毒S1蛋白重組表達及抗S1蛋白單克隆抗體的制備16-31
• 2.1 材料與方法16-22
• 2.2 結果22-29
• 2.2.1 MERS病毒S1蛋白在昆蟲細胞中的重組表達及鑒定22-24
• 2.2.2 MERS病毒S1重組蛋白免疫原性及免疫反應特征分析24-26
• 2.2.3 MERS病毒S1重組蛋白免疫小鼠血清抗體中和活性檢測26
• 2.2.4 抗MERS病毒S1單克隆抗體的制備及鑒定26-29
• 2.3 討論29-31
• 3 MERS病毒RBD蛋白在昆蟲細胞中重組表達及免疫保護作用分析31-50
• 3.1 材料與方法31-36
• 3.2 實驗結果36-47
• 3.2.1 MERS病毒RBD重組蛋白在昆蟲細胞中重組表達與鑒定36-42
• 3.2.2 MERS病毒RBD重組蛋白抗原性及免疫反應特征分析42-43
• 3.2.3 MERS病毒RBD重組蛋白免疫小鼠血清抗體活病毒中和活性分析43-44
• 3.2.4 SARS病毒RBD與MERS病毒RBD交叉反應性以及交叉中和活性的比較44-47
• 3.3 討論47-50
• 4. 結論50-51
• 參考文獻51-55
• 附錄55-61
• 攻讀碩士期間研究成果61-62
• 簡歷62-63
• 致謝63-65
• 綜述65-74
• 參考文獻72-74

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本文編號：496248