本文關(guān)鍵詞：GPI錨固蛋白CD59通過LAT介導(dǎo)T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討在T系急性白血病的Jurkat細胞中,GPI錨固蛋白CD59通過接頭分子LAT介導(dǎo)細胞的增殖、活化、凋亡等生物學(xué)效應(yīng),研究GPI類錨固分子CD59介導(dǎo)T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機制。方法:分別構(gòu)建LAT-EGFP(LAT組,LAT分子高表達)、LAT-M-EGFP(LAT-M組,LAT分子的棕櫚酰化位點突變)、neg-EGFP(neg組,陰性對照組)融合蛋白,以慢病毒為載體,轉(zhuǎn)染入Jurkat細胞中,建立穩(wěn)定表達的細胞株。CD59單克隆抗體交聯(lián)刺激CD59分子前后,利用激光共聚焦顯微鏡觀察CD59和LAT分子在細胞膜上的定位和分布情況;利用CCK8和流式細胞術(shù)檢測各組細胞的增殖活性和凋亡情況;通過電鏡觀察各組細胞中細胞器的變化情況;利用q RT-PCR和Western blot在m RNA和蛋白水平檢測T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號分子的表達情況。結(jié)果:共聚焦顯微鏡下觀察到各組細胞的轉(zhuǎn)染效率均在80%以上,轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。LAT組中,CD59和LAT分子均表達于細胞膜上且部分LAT分子有點簇狀聚集區(qū)-脂筏所在部位;CD59單克隆抗體交聯(lián)刺激后,CD59和LAT的點簇狀聚集區(qū)更為明顯且共同定位于脂筏。LAT-M組中,LAT分子在細胞膜上散在分布,未出現(xiàn)點簇狀聚集區(qū);CD59抗體作用后無明顯變化。與陰性對照組相比,LAT組的細胞增殖活性最高且出現(xiàn)明顯的中晚期凋亡現(xiàn)象,LAT-M組細胞的增殖活性最低,中晚期凋亡率最高;CD59抗體作用后,LAT組和neg組細胞增殖活性均明顯增高,neg組細胞凋亡減少,LAT組無明顯變化,LAT-M組細胞凋亡增加。在基因水平上,LAT組的表達高于neg組和LAT-M組,CD59抗體交聯(lián)刺激后,LAT組無明顯變化,neg組和LAT-M組均較刺激前有所增加。Western blot結(jié)果顯示,CD59抗體交聯(lián)后,LAT組和neg組的非磷酸化蛋白表達水平均明顯降低,LAT-M組無明顯變化。結(jié)論:GPI錨固蛋白CD59通過跨膜接頭蛋白LAT對T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮調(diào)控作用,且LAT的棕櫚�；瞧浒l(fā)揮功能所必需的。這為其它GPI類錨固分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制研究提供了新視野和新方向。
【關(guān)鍵詞】：CD59 Jurkat細胞 LAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-8
• 技術(shù)路線8-9
• 第一章 材料與方法9-19
• 1.1 材料9-10
• 1.1.1 主要實驗儀器9
• 1.1.2 病毒與細胞株9
• 1.1.3 主要實驗試劑9-10
• 1.2 方法10-19
• 1.2.1 Jurkat細胞的培養(yǎng)10-11
• 1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞11
• 1.2.3 免疫熒光11-12
• 1.2.4 CCK8檢測細胞增殖活性12
• 1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡12-13
• 1.2.6 電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)13
• 1.2.7 qRT-PCR13-15
• 1.2.8 Western blot15-18
• 1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析18-19
• 第二章 實驗結(jié)果19-30
• 2.1 Jurkat細胞的培養(yǎng)19
• 2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞19-20
• 2.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染后的Jurkat細胞19-20
• 2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率20
• 2.3 免疫熒光20-21
• 2.4 CCK8法檢測各組Jurkat細胞的增殖活性21-22
• 2.5 流式細胞術(shù)檢測各組Jurkat細胞的凋亡22-25
• 2.6 電鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)25-26
• 2.7 qRT-PCR檢測T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達26-28
• 2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達28-30
• 第三章 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻33-36
• 綜述36-48
• 綜述參考文獻44-48
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果48-49
• 附錄49-51
• 致謝51-52

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