結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)簡稱結核桿菌,是結核病的病原菌,目前世界上約1/3的人口感染結核分枝桿菌,其中5%-10%的感染者將發(fā)展成為活動性結核病,全球每年新增結核病患者約880萬,死亡約300萬。細胞凋亡是細胞發(fā)生的一種程序性死亡,在組織分化、器官發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)等生理過程中發(fā)揮著重要作用。盡管細胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象,但是異常的細胞凋亡常引起許多疾病。調(diào)節(jié)宿主細胞凋亡是結核分枝桿菌致病性的一部分,影響結核分枝桿菌的生存、繁殖、擴散等過程。快速準確的檢測細胞凋亡是研究凋亡相關機制以及評價凋亡對疾病過程影響的基礎。Caspase-3的激活是細胞凋亡的重要標志,常被應用于凋亡檢測方法的建立。為了方便快速的檢測結核分枝桿菌蛋白對細胞凋亡的影響,本研究將caspase-3的識別序列與螢火蟲熒光素酶融合表達構建了一個新型的caspase-3報告質粒,用于細胞凋亡的檢測,并篩選了部分結核分枝桿菌編碼的蛋白,具體研究內(nèi)容如下:1.Caspase-3報告質粒的構建及驗證本研究構建了四種caspase-3報告質粒,將四種報告質粒分別轉染He La細胞,在細胞...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表（ABBREVIATION）
第1章 文獻綜述
    1.1 細胞凋亡簡介
    1.2 細胞凋亡特征
        1.2.1 細胞凋亡形態(tài)學特征
        1.2.2 DNA片段化
        1.2.3 組織谷氨酰胺轉移酶活化
    1.3 細胞凋亡信號通路
        1.3.1 死亡受體通路
        1.3.2 線粒體通路
        1.3.3 內(nèi)質網(wǎng)通路
    1.4 細胞凋亡檢測方法
        1.4.1 形態(tài)學觀察
        1.4.2 DNA片段化檢測
        1.4.3 磷脂酰絲氨酸定位檢測
        1.4.4 凋亡相關基因檢測
        1.4.5 新型細胞凋亡檢測方法
    1.5 結核分枝桿菌與細胞凋亡
        1.5.1 抑制細胞凋亡
        1.5.2 促進細胞凋亡
        1.5.3 ESAT-6 家族蛋白與細胞凋亡
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 試驗材料
        3.1.1 細胞與菌株
        3.1.2 引物、載體
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基和抗生素的配制
        3.1.5 主要緩沖液和試劑及其配制
        3.1.6 主要實驗儀器及設備
        3.1.7 分子生物學分析軟件
        3.1.8 統(tǒng)計學方法
    3.2 試驗方法
        3.2.1 報告質粒的構建
        3.2.2 ESAT-6 家族蛋白真核表達質粒的構建
        3.2.3 酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.4 外源DNA片段與質粒載體的連接反應
        3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉化
        3.2.7 質粒的制備與鑒定
        3.2.8 質粒轉染（脂質體介導轉染法）
        3.2.9 雙熒光素酶檢測實驗
        3.2.10 細胞凋亡檢測
        3.2.11 實時熒光定量PCR
        3.2.12 Western Blot樣品準備
第4章 結果與分析
    4.1 Caspase-3 報告質粒的構建
    4.2 Caspase-3 報告質粒的驗證
    4.3 結核分枝桿菌ESAT-6 家族蛋白的篩選
    4.4 篩選結果的驗證
    4.5 核因子-kB（NF-kB）參與esxT誘導的細胞凋亡
第5章 討論與結論
    5.1 討論
        5.1.1 Npu DnaE內(nèi)含肽的選擇
        5.1.2 真核表達的選擇
        5.1.3 促進TNF-α 誘導細胞凋亡的篩選
        5.1.4 結核分枝桿菌ESAT-6 家族蛋白的篩選及驗證
    5.2 結論
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3865684