第一部分 KLF9對(duì)PGC1a表達(dá)的調(diào)控以及在糖異生中的作用 肝臟糖異生對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間饑餓情況下生物體的生存十分必要,但是在糖尿病情況下被非正常開啟。已知轉(zhuǎn)錄共激活因子過(guò)氧化物酶體增殖受體Y共激活因子1(PGC1a)在此過(guò)程中發(fā)揮重要的生理功能。PGC1a是糖異生酶基因的上游調(diào)控因子,對(duì)于這些酶表達(dá)的激活發(fā)揮重要的調(diào)控功能。PGC1a被cAMP通路和轉(zhuǎn)錄因子CREB的激活所調(diào)控。KLF9是Kruppel-like factors鋅指蛋白家族的成員,又稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列結(jié)合蛋白1(BTEB1),是結(jié)合高GC結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄因子。KLF9能夠調(diào)節(jié)孕酮受體(PR)的表達(dá),其缺失會(huì)降低子宮PR目標(biāo)基因?qū)τ谠型拿舾行?導(dǎo)致生育能力低下。在肝臟中,KLF9結(jié)合促進(jìn)HNF4a,調(diào)節(jié)甲狀腺激素在肝臟中的作用。KLF9能夠結(jié)合PPARγ啟動(dòng)子,調(diào)控脂肪組織的發(fā)育。通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),我們證明了KLF9能夠結(jié)合到PGC1a啟動(dòng)子并調(diào)節(jié)的PGC1a的表達(dá),進(jìn)而,對(duì)肝臟糖異生酶的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控。在糖尿病模型小鼠上,降低KLF9的表達(dá)量,能夠有效提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性,并且對(duì)糖尿病造成的高血糖具有改善效果。本實(shí)驗(yàn)首...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
第一部分 KLF9對(duì)PGC1A表達(dá)的調(diào)控以及在糖異生中的作用
    摘要
    ABSTRACT
    前言
    材料和方法
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 動(dòng)物
            1.2 菌株
            1.3 質(zhì)粒載體
            1.4 細(xì)胞株
            1.5 實(shí)驗(yàn)用工具酶以及DNA,蛋白marker
            1.6 試劑盒
            1.7 主要化學(xué)試劑(按試劑公司分類)
            1.8 主要儀器及設(shè)備
            1.9 分析軟件
            1.10 實(shí)驗(yàn)所用引物
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
                2.1.1 PCR法擴(kuò)增目的片段
                2.1.2 PCR點(diǎn)突變KLF-9在PGC1α啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)
                2.1.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳
                2.1.4 DNA及載體的酶切
                2.1.5 片段與載體的連接
                2.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                2.1.7 陽(yáng)性克隆的篩選
                2.1.8 質(zhì)粒DNA的大量制備
            2.2 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
                2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)條件
                2.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇,傳代培養(yǎng)與凍存
                2.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試
                2.2.4 肝原代細(xì)胞的分離以及培養(yǎng)
                2.2.5 3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
                2.2.6 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
            2.3 重組腺病毒的構(gòu)建與包裝
            2.4 腺病毒感染細(xì)胞
            2.5 染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            2.6 DNA、RNA提取及cDNA的合成
                2.6.1 總RNA的提取
                2.6.2 總DNA和蛋白質(zhì)的分離提取
                2.6.3 總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            2.7 WESTERN BLOT
                2.7.1 SDS-PAGE電泳
                2.7.2 SDS-PAGE電泳步驟
                2.7.3 轉(zhuǎn)膜
                2.7.4 Western印跡雜交
            2.8. Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)
            2.9 dual luciferase reporter assay system實(shí)驗(yàn)
            2.10 小鼠血糖測(cè)定
            2.11 GTT,ITT實(shí)驗(yàn)
        3 實(shí)驗(yàn)流程
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. KLF9和PGC1A基因表達(dá)被饑餓誘導(dǎo)
        2. KLF9調(diào)控PGC1A轉(zhuǎn)錄是通過(guò)結(jié)合在PGC1A啟動(dòng)子上實(shí)現(xiàn)
        3. KLF9和PGC1A在體內(nèi)的相互作用
        4. 干擾KLF9表達(dá)對(duì)糖異生調(diào)控基因表達(dá)的影響
        5. 干擾KLF9表達(dá)降低肝原代細(xì)胞的葡萄糖輸出
    討論
    小結(jié)
第二部分 PGC1A與PPARF共激活CIDEC的表達(dá)
    摘要
    ABSTRACT
    前言
    材料與方法見(jiàn)第一部分
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1. PPARΓ與PGC1A直接結(jié)合于CIDEC的啟動(dòng)子而調(diào)控轉(zhuǎn)錄
        2. PPARΓ特異激動(dòng)劑PIOGLITAZONE可促進(jìn)CIDEC MRNA的轉(zhuǎn)錄
        3. CIDEC過(guò)表達(dá)的3T3-L1細(xì)胞中對(duì)脂肪合成以及能量代謝相關(guān)基因的影響
        4. 在肝臟細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CIDEC基因明顯增加細(xì)胞質(zhì)脂滴的體積
    討論
    小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3828230