發(fā)布時間：2017-05-20 10:05

  本文關鍵詞：高效經(jīng)濟型飼養(yǎng)層細胞制備體系的研究和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前廣泛使用的絲裂霉素C（MMC）法制備飼養(yǎng)層（Feeder）細胞（簡稱“傳統(tǒng)方法”）有諸多問題有待優(yōu)化：（1）產(chǎn)量低，成本高，消耗大量的人力物力；（2）易出現(xiàn)細胞增殖抑制不充分；（3）小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的生物學行為易受影響，得到的Feeder細胞質量不高；（4）操作不靈活，易錯過最佳處理時機等。因此，有必要開發(fā)新的方法，既能單批獲得大量高質量的Feeder細胞，又能保證細胞增殖被充分抑制。 首先，本研究在傳統(tǒng)方法基礎上進行改進優(yōu)化，建立了懸浮-貼壁法，它能提高抑制細胞有絲分裂的效率，同時，還能篩選出狀態(tài)良好的細胞作為Feeder，，提高所得Feeder的質量。而且，我們無需密切觀察MEFs的生長密度，不用擔心錯過最佳處理時間，操作更為靈活方便。 其次，本研究對懸浮-貼壁法進一步優(yōu)化，建立了利用細胞培養(yǎng)轉瓶機CELLSPINSystem快速制備Feeder細胞的方法。CELLSPIN System的攪拌錘可在電磁場作用下不斷旋轉，能使細胞在懸浮狀態(tài)下與培養(yǎng)基中的MMC充分接觸，可明顯提高MMC抑制細胞增殖的效率，縮短處理時間；懸浮狀態(tài)下處理細胞，回收時無需消化液消化，可減少酶消化帶來的細胞損傷，最大限度地保持細胞的良好狀態(tài)；旋轉瓶的容積是普通培養(yǎng)瓶/皿的數(shù)倍甚至上百倍，短時間內(nèi)可處理大量細胞，在提高Feeder制備效率的同時，又能明顯降低Feeder細胞的制備成本。所以，細胞培養(yǎng)轉瓶機法便于人胚胎干細胞（hESCs）和人誘導型多潛能干細胞（hiPSCS）的大規(guī)模生產(chǎn)。
【關鍵詞】：CF-1小鼠胚胎成纖維細胞 飼養(yǎng)層細胞 人胚胎干細胞 人誘導型多潛能干細胞 絲裂霉素C
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-6
• 英文縮略詞表6-9
• 第1章 引言9-20
• 1.1 依賴 FEEDER 的培養(yǎng)體系9-13
• 1.1.1 動物源性 Feeder 培養(yǎng)體系9-11
• 1.1.2 人源性 Feeder 培養(yǎng)體系11-13
• 1.2 FEEDER-FREE 培養(yǎng)體系，組分從不明確到明確的過程13-17
• 1.2.1 成分不明確的條件培養(yǎng)基體系13
• 1.2.2 成分明確的培養(yǎng)體系13-17
• 1.3 新型生物合成材料構建的培養(yǎng)體系17
• 1.4 3D 生物反應器懸浮培養(yǎng)體系17
• 1.5 存在的問題展望17-20
• 第2章 材料與方法20-29
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 主要儀器和設備20
• 2.1.2 主要試劑20-21
• 2.2 實驗方法21-29
• 2.2.1 CF-1 MEFs 的原代獲取21
• 2.2.2 CF-1 MEFs 的傳代21-22
• 2.2.3 CF-1 MEFs 的凍存22
• 2.2.4 CF-1 MEFs 的復蘇22
• 2.2.5 傳統(tǒng)方法 Feeder 細胞的制備22-23
• 2.2.6 懸浮-貼壁法 Feeder 細胞的制備( 圖 2.1 )23-24
• 2.2.7 攪拌式細胞培養(yǎng)轉瓶機法 Feeder 細胞的制備( 圖 2.2 )24-25
• 2.2.8 細胞計數(shù)25
• 2.2.9 EdU 檢測25
• 2.2.10 傳統(tǒng)方法、懸浮-貼壁法和細胞培養(yǎng)轉瓶機法直接貼壁率比較25
• 2.2.11 傳統(tǒng)方法、懸浮-貼壁法和細胞培養(yǎng)轉瓶機法復蘇率比較25
• 2.2.12 傳統(tǒng)方法、懸浮-貼壁法和細胞培養(yǎng)轉瓶機法存活時間比較25-26
• 2.2.13 流式細胞周期 Feeder 細胞凋亡檢測26
• 2.2.14 質譜法 MMC 殘余量檢測26
• 2.2.15 Feeder 與 hHF-MSC-iPSCs 共培養(yǎng)26
• 2.2.16 hESC 多能性標記物鑒定26-27
• 2.2.17 體外擬胚體形成試驗27-28
• 2.2.18 體內(nèi)畸胎瘤形成試驗28-29
• 第3章 實驗結果29-47
• 3.1 原代 CF-1 MEFS 獲得及傳代培養(yǎng)29
• 3.2 傳統(tǒng)方法 FEEDER 細胞的制備29-31
• 3.3 懸浮-貼壁法 FEEDER 細胞的制備31-35
• 3.4 攪拌式細胞培養(yǎng)轉瓶機法制備 FEEDER 細胞35-37
• 3.5 傳統(tǒng)方法、懸浮-貼壁法與細胞培養(yǎng)轉瓶機法對比試驗37-39
• 3.6 流式細胞周期檢測 FEEDER 細胞凋亡39-41
• 3.7 質譜法 MMC 殘余量檢測41-43
• 3.8 傳統(tǒng)方法、懸浮-貼壁法和細胞培養(yǎng)轉瓶機法制備的 FEEDER 細胞均能很好的支持 HHF-MSC-IPSCS的生長43-44
• 3.9 HHF-MSC-IPSCS 標記物鑒定44
• 3.10 HHF-MSC-IPSCS 多潛能性鑒定44-47
• 第4章 討論47-50
• 第5章 結論50-51
• 參考文獻51-57
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果57-58
• 致謝58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Chuanying Pan;Amy Hicks;Colin E Bishop;;SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells[J];遺傳學報;2010年04期

  本文關鍵詞：高效經(jīng)濟型飼養(yǎng)層細胞制備體系的研究和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：381288