目的:克隆人腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒A組16型(CA16)的VP1蛋白編碼基因,構(gòu)建相應(yīng)真核表達質(zhì)粒在體外進行重組表達,檢測其細胞內(nèi)定位,為EV71及CA16的疫苗研究提供基礎(chǔ)。方法:通過PCR擴增分別獲取EV71及CA16的VP1編碼序列,插入pcFlag載體,分別構(gòu)建EV71及CA16 VP1與FLAG標(biāo)簽融合的真核表達質(zhì)粒;瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞及橫紋肌肉瘤RD細胞,Western blot法檢測融合蛋白的表達,免疫熒光檢測融合蛋白的細胞內(nèi)定位情況。結(jié)果:測序表明兩種來源VP1蛋白的重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確;分別轉(zhuǎn)染兩種不同的細胞后,均可通過Western blot檢測到相應(yīng)蛋白表達;免疫熒光檢測顯示兩種毒株的VP1均表達在細胞質(zhì)中。結(jié)論:外源融合表達EV71或CA16 VP1蛋白的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功;所構(gòu)建質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞后,均可在細胞質(zhì)內(nèi)檢測到VP1融合蛋白的表達。

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 病毒RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄
    1.3 目的片段獲取
    1.4 重組載體構(gòu)建與鑒定
    1.5 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
    1.6 Western blot檢測外源蛋白表達
    1.7 免疫熒光檢測外源蛋白細胞內(nèi)定位
2 結(jié)果
    2.1 CA16和EV71毒株VP1片段的擴增
    2.2 CA16和EV71毒株VP1片段及真核表達載體pcFlag的酶切回收與連接
    2.3 含有CA16和EV71毒株VP1的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
    2.4 VP1蛋白在細胞中的外源重組表達
    2.5 重組VP1蛋白在細胞內(nèi)的定位
3 討論



本文編號：3750530