神經(jīng)類退行性疾病如阿爾茲海默病、帕金森綜合征、亨廷頓舞蹈癥能毀滅性地影響患者的運(yùn)動(dòng)能力或記憶功能,給親屬及其社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān),且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合適的細(xì)胞或動(dòng)物模型進(jìn)行藥物治療研究。小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）因其具有能分化成三個(gè)胚層細(xì)胞的多能性且不存在倫理問(wèn)題而被廣泛運(yùn)用在各個(gè)研究領(lǐng)域。然而,體外mESCs的譜系特化是不同步且難以控制的,就神經(jīng)譜系的特化而言,目前尚沒(méi)有一個(gè)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)用于指示mESCs的神經(jīng)分化。神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）是指可以分化到多種神經(jīng)元的神經(jīng)前體細(xì)胞,是mESCs分化到神經(jīng)元的中間態(tài)細(xì)胞,它既可以通過(guò)分離早期胚胎的大腦組織獲得,也可以利用ESCs進(jìn)行體外分化獲得,其在臨床細(xì)胞替代性治療方面有很大的應(yīng)用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的過(guò)程中,除實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞表型變化外,沒(méi)有一個(gè)科學(xué)的系統(tǒng)行之有效地指示分化的進(jìn)程,并且體外分化周期長(zhǎng),效率較低,導(dǎo)致最終獲得的NPCs細(xì)胞數(shù)量不足以達(dá)到細(xì)胞替代治療的需求,其根本原因還在于調(diào)控小鼠ESCs進(jìn)行神經(jīng)分化的分子機(jī)制尚不明確。因此,亟需一種高效和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南到y(tǒng)直觀地對(duì)小鼠ESCs神經(jīng)分化進(jìn)程進(jìn)... 

【文章來(lái)源】：南開(kāi)大學(xué)天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)生和分化

而神經(jīng)元不具有可再生能力，要解決此類問(wèn)題，以神經(jīng)祖細(xì)胞為研究平臺(tái)能更好地推動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞替代治療或者神經(jīng)類藥物篩選的研究和運(yùn)用。傳統(tǒng)的體外誘導(dǎo)ES向神經(jīng)祖細(xì)胞方向分化主要有三種策略（圖1.2）�；跀M胚體(EB)的分化：將消化后的干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)能自發(fā)聚集形成EB球，其特性類似于原腸胚，球內(nèi)的細(xì)胞相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞分化成為三個(gè)胚層的多種細(xì)胞。通過(guò)暴露于視黃酸或HepG2（肝癌細(xì)胞系）條件培養(yǎng)基或者特定神經(jīng)選擇性培養(yǎng)基，EB球就能夠定向向神經(jīng)譜系分化，但是其分化效率不高，僅有部分細(xì)胞能分化成神經(jīng)祖細(xì)胞[20-24]�；谏窠�(jīng)誘導(dǎo)基質(zhì)飼養(yǎng)層的分化：從胚胎骨髓或者主動(dòng)脈-性腺-中腎（AGM）區(qū)分離出的基質(zhì)間充質(zhì)細(xì)胞系再在脂肪細(xì)胞分化前期，具有高效神經(jīng)誘導(dǎo)效能。將其與mESCs于無(wú)血清條件培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)ES向神經(jīng)方向分化。通過(guò)隨時(shí)調(diào)整條件培養(yǎng)基，用以獲得中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞亞型的定向分化。該方法由于其誘導(dǎo)機(jī)制尚不明確，且隨機(jī)性較強(qiáng)[25

第一章 引言具有Pax6-GFP報(bào)告系統(tǒng)的mESCs細(xì)胞系，將作為一種理想的工具細(xì)胞運(yùn)用于大規(guī)模神經(jīng)分化相關(guān)基因和藥物的篩選研究。主要技術(shù)路線如下（圖1.3）。圖 1.3 快速高效獲得高純度NPCs的技術(shù)路線圖主要實(shí)驗(yàn)步驟為：（1）構(gòu)建GFP同源重組供體質(zhì)粒、Cas9表達(dá)質(zhì)粒和靶向Pax6基因的特異性sgRNA質(zhì)粒；（2）通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)的方式將質(zhì)粒導(dǎo)入到mESCs細(xì)胞中；（3）通過(guò)篩選標(biāo)記篩選出構(gòu)建成功的Pax6-GFP mESCs系并完成基因型鑒定；（4）體內(nèi)和體外對(duì)Pax6-GFP細(xì)胞系進(jìn)行神經(jīng)分化的驗(yàn)證；（5）通過(guò)流式分選和培養(yǎng)GFP陽(yáng)性細(xì)胞并鑒定其NPCs屬性。


本文編號(hào)：3596157