發(fā)布時間：2017-05-12 10:12

  本文關鍵詞：家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對原代FBL-3細胞作用機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.利用家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物,來探究其對原代FBL-3細胞增殖周期是否存在影響。原代FBL-3細胞的獲取是通過構建小鼠腫瘤模型來完成的。原代FBL-3細胞能夠在生物學性能方面保持最佳狀態(tài),減少對實驗數據的干擾。因此提取原代FBL-3細胞進行實驗具有重要意義,能夠提高實驗的科學性。2.研究家蠅幼蟲抗菌肽粗提物是否通過細胞膜途徑對原代FBL-3細胞發(fā)揮抑制作用。當家蠅幼蟲抗菌肽作用FBL-3細胞后,在顯微鏡下可觀察到細胞碎片,細胞質涌出,通過熒光素與抗菌肽連接來驗證家蠅幼蟲抗菌肽在抑殺FBL-3細胞時是否存在細胞膜機制。3.抗菌肽抗腫瘤實驗多是在細胞離體條件下進行的,抗菌肽在生物體內是否也能發(fā)揮作用值得去研究。利用原代FBL-3細胞成功構建了小鼠模型,進而為研究家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物在生物體內是否發(fā)揮作用提供前提條件。通過腹腔注射給藥進行干預,觀察家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物在模型小鼠體內的作用效果。方法:活化大腸桿菌并配制成實驗所需濃度的菌液,2號昆蟲針經酒精燈灼燒后伸入裝有菌液的試管內,利用蘸有菌液的昆蟲針去刺破已飼養(yǎng)好的三齡幼蟲的體壁,進行抗菌肽的誘導。繼續(xù)飼養(yǎng)至24 h后,將幼蟲放入提前冷凍半小時的玻璃研缽內,加入配制好的溶液進行低溫碾磨。將碾磨好的物質放入1.5 m L的EP管內,然后將低溫離心機的模式設置為4℃、12000 r/min,進行30分鐘的離心,重復操作2次。之后得到的上清液進行固相萃取,便可獲得粗提取的家蠅幼蟲抗菌肽。對健康的C57BL/6小鼠進行挑選:雄性、體重在(20±1)g左右,構建小鼠腫瘤模型。待FBL-3細胞生長至對數增生期后,利用胰酶充分消化,終止后放入離心管內并用移液槍進行吹打,調整濃度制成實驗所需的懸液。經右腋皮下注射到小鼠體內,約一周后可在小鼠右腋下方觸摸到腫瘤團塊,剝離瘤塊提取原代FBL-3細胞,常規(guī)培養(yǎng)。利用CCK-8、MTT實驗檢測家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對FBL-3細胞毒力的大小,通過臺盼藍拒染的實驗方法計算FBL-3存活率的高低。家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用于原代FBL-3細胞,調整其作用濃度并使之形成濃度梯度,通過實驗結果計算得知原代FBL-3細胞在其不同濃度作用時的細胞毒力和存活率的大小。利用統(tǒng)計學方法對獲得的所有實驗數據進行分析。利用流式細胞儀對經過家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物作用后的原代FBL-3的細胞增殖周期的分布情況進行檢測。將熒光素與家蠅幼蟲抗菌肽進行連接并作用于原代FBL-3細胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,證明是否存在細胞膜機制。將家蠅幼蟲抗菌肽經腹腔注射到構建模型成功的小鼠體內,根據注射劑量分為低劑量、中劑量、高劑量組,同時設置陰性對照組與陽性對照組,進行為期一周的干預。每天觀察并記錄小鼠的生存狀況以及腫瘤的生長大小,一周干預結束后對小鼠頸椎脫臼進行處死,剝離腫瘤團塊并進行稱重,比較重量的大小并計算抑瘤率。結果:小鼠腫瘤模型的成功構建,為獲取實驗所需的原代FBL-3細胞提供了前提條件。原代FBL-3細胞具有最佳的生物學性能,得到的原代細胞能夠快速增殖并能傳代生長,為后續(xù)的實驗提供了便利。原代細胞的成功獲取,降低了FBL-3隨傳代次數增多導致的細胞活性不佳對實驗數據正確性的干擾,提高了實驗數據的可利用性。CCK-8、MTT毒性試驗和臺盼藍檢測獲得的細胞毒力及存活率確定了抗菌肽對原代FBL-3發(fā)揮作用的最佳濃度為300μg/m L。同時證明抗菌肽的作用強度存在濃度閾值的現象。當家蠅幼蟲抗菌肽達到300μg/m L的濃度時,對FBL-3細胞的相對抑制率達到了最大為55.60%,當低于300μg/m L的濃度時,抗菌肽發(fā)揮的強度隨作用濃度的增大而增強;當高于300μg/m L的濃度時,抗菌肽發(fā)揮的強度隨作用濃度的增大而減弱。細胞周期的檢測結果為:原代FBL-3細胞經家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物作用之后,其增殖周期發(fā)生了不可逆的變化,處在G0/G1期的細胞比例出現上升,處在S期的細胞比例出現了下降。當恒定家蠅幼蟲抗菌肽的濃度不變時,其對FBL-3的細胞增殖周期的作用效果是隨著作用時間延長而增強的;當恒定家蠅幼蟲抗菌肽的作用時間時,其作用效果是隨著濃度的提升而增強的。說明家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對細胞周期的作用存在劑量-時間依賴的特性。FBL-3細胞經家蠅幼蟲抗菌肽作用之后于顯微鏡下觀察,鏡下發(fā)現細胞破碎并成片漂浮,細胞膜出現孔洞導致內容物發(fā)生外涌。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到,連接熒光素的抗菌肽侵入到了細胞內部,細胞發(fā)出熒光綠,說明抗菌肽破壞細胞膜使之出現了孔洞,以此進入到細胞內部。將粗提取獲得的家蠅抗菌肽經腹腔注射的方式注入到模型小鼠體內。實驗結果表明抗菌肽低、中、高劑量組在小鼠體內對FBL-3細胞形成的腫瘤都具有一定的抑制作用,抑制作用的強度隨著抗菌肽劑量的增大而增強,是一種劑量-效應關系,抑制率分別為36.25%、42.38%、48.64%。經家蠅幼蟲抗菌肽干預的模型小鼠,生存狀態(tài)較陰性對照組小鼠得到了明顯的改觀。結論:1.家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對原代FBL-3細胞發(fā)揮作用時存在細胞周期機制,它能夠阻滯細胞增殖周期進而使得FBL-3發(fā)生死亡。原代FBL-3的增殖周期發(fā)生了不可逆的變化,細胞處在G0/G1期的比例出現了升高,處在S期的比例出現了降低。2.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠通過作用于細胞膜使其產生孔洞從而抑殺原代FBL-3細胞,其作用強度存在濃度閾值的現象。家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物的濃度達到300μg/m L時,它能夠發(fā)揮最強的作用效果。3.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物在模型小鼠體內能夠明顯地抑制腫瘤的生長,具有可觀的抑瘤率,并能明顯改善模型小鼠的生長狀態(tài)。
【關鍵詞】：家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物 原代FBL-3細胞 細胞周期 細胞膜機制 荷瘤小鼠
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R384.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對原代FBL-3 細胞增殖周期的影響15-26
• 1 材料與方法15-19
• 1.1 材料15-16
• 1.2 方法16-19
• 2 結果19-23
• 2.1 模型小鼠腫瘤生長情況19
• 2.2 原代FBL-3 細胞的生長情況19
• 2.3 家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物影響原代FBL-3 細胞的增殖周期19-23
• 3 討論23-25
• 4 結論25-26
• 第二部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對原代FBL-3 細胞膜作用的研究26-35
• 1 材料與方法26-30
• 1.1 實驗材料26-27
• 1.2 實驗方法27-30
• 2 結果30-32
• 2.1 CCK-8 細胞毒性試驗結果30
• 2.2 細胞生存率結果30-31
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察結果31-32
• 3 討論32-34
• 4 結論34-35
• 第三部分 家蠅幼蟲抗菌肽粗體物對荷瘤小鼠作用的實驗研究35-43
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 材料35-36
• 1.2 方法36-38
• 2 結果38-40
• 2.1 小鼠模型構建結果38
• 2.2 MTT試驗結果38-39
• 2.3 不同干預后腫瘤生長情況及小鼠存活狀況39-40
• 3 討論40-42
• 4 結論42-43
• 參考文獻43-47
• 綜述47-59
• 參考文獻56-59
• 致謝59-61
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個人簡歷62

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1 聶守民;家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對原代FBL-3細胞作用機制的研究[D];山西醫(yī)科大學;2016年

  本文關鍵詞：家蠅幼蟲抗菌肽的粗提取物對原代FBL-3細胞作用機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：359485