腸道病毒EV71是引起手足口�。╤and,foot and mouth disease HFMD）的主要病原體,其感染人群主要為嬰幼兒,癥狀輕微者會出現(xiàn)斑丘疹和皰疹,而嚴重的患者會出現(xiàn)神經(jīng)性系統(tǒng)疾病,如病毒性腦膜炎、腦炎、腦干腦炎和急性弛緩性麻痹等,嚴重威脅到公共安全。本論文采用經(jīng)典的單克隆抗體技術,制備和篩選了針對EV71非結構蛋白靶標2A和表面結構蛋白靶標VP1的系列單克隆抗體,并對這些抗體進行了鑒定和初步的研究分析。1.利用原核表達的2A蛋白免疫小鼠,通過細胞融合篩選分泌2A特異性IgG的雜交瘤細胞株,并根據(jù)抗體類別轉(zhuǎn)換機制,采用有限稀釋法進一步篩選獲得2A特異性IgA型雜交瘤細胞株2A5 IgA和5F11 IgA。利用小鼠腹水制備獲得大量純化的IgA和IgG單克隆抗體,通過體外Transwell系統(tǒng)極化上皮細胞測定IgA抗體通過上皮細胞轉(zhuǎn)運活性及其對EV71病毒復制的影響。結果表明,這兩株2A特異性抗體2A5 IgA和5F11 IgA均能通過上皮細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,并有效抑制病毒復制,且這種抑制效應依賴于IgA抗體的濃度。2.采用同樣的雜交瘤技術路線也篩選獲得9株VP1特異性IgG雜交... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)湖北省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 EV71的流行病學介紹
    1.2 EV71的病毒學特征
    1.3 EV71疫苗研究現(xiàn)狀
    1.4 EV712A蛋白及其功能
    1.5 黏膜免疫系統(tǒng)和分泌性sIgA
    1.6 EV71VP1蛋白和抗體依賴性增強效應
    1.7 單克隆抗體技術
    1.8 利用抗體類型轉(zhuǎn)換獲得產(chǎn)IgA的雜交瘤細胞株
    1.9 通透膜系統(tǒng)(Transwell System)模擬體內(nèi)黏膜系統(tǒng)微環(huán)境
    1.10 本研究的目的和意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗儀器與材料
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗用耗材
        2.1.4 生物材料
        2.1.5 溶液和培養(yǎng)基配方
    2.2 實驗方法
        2.2.1 腸道病毒EV71 mRNA的提取
        2.2.2 pET-28a-2A和pET-28a-VP1克隆構建
        2.2.3 蛋白的表達純化及檢測
        2.2.4 蛋白檢測
        2.2.5 細胞傳代培養(yǎng)凍存和復蘇
        2.2.6 細胞融合
        2.2.7 雜交瘤細胞上清檢測(ELISA)
        2.2.8 融合細胞的單克隆化
        2.2.9 有限稀釋法篩選IgA分泌型單克隆雜交瘤細胞株
        2.2.10 免疫熒光驗證IgG/IgA分泌型單克隆雜交瘤細胞株的特異性
        2.2.11 腹水制備與抗體純化
        2.2.12 Transwell模型培養(yǎng)極化的上皮細胞
        2.2.13 Transwell極化細胞的生長和電阻的測定
        2.2.14 Transwell中的抗體效應實驗
        2.2.15 經(jīng)典中和實驗檢測VP1-IgGs的體外中和活性
        2.2.16 THP-1細胞中驗證病毒的抗體依賴性增強作用
第3章 實驗結果
    3.1 EV712A特異性IgA單克隆抗體的制備及其對病毒復制的影響
        3.1.1 EV71BrCr株2A蛋白原核表達克隆構建
        3.1.2 EV71 2A蛋白的誘導表達純化和鑒定
        3.1.3 EV71 2A特異性雜交瘤細胞的篩選和鑒定
        3.1.4 利用競爭性ELISA驗證2A蛋白單克隆抗體識別表位
        3.1.5 利用抗體類型轉(zhuǎn)換篩選特異性的產(chǎn)IgA的雜交瘤細胞株
        3.1.6 腹水制備與抗體純化
        3.1.7 IgA抗體在Transwell系統(tǒng)中的定向轉(zhuǎn)運
        3.1.8 EV71在Transwell系統(tǒng)中的復制曲線的測定
        3.1.9 2A-IgA在Transwell系統(tǒng)中的胞內(nèi)中和測定
        3.1.10 2AIgA胞內(nèi)中和的濃度依賴效應
    3.2 EV71 VP1特異性IgG單克隆抗體的篩選及其對病毒復制的影響
        3.2.1 EV71 BrCr株VP1蛋白原核表達克隆構建
        3.2.2 EV71 VP1蛋白的誘導表達純化和鑒定
        3.2.3 EV71 VP1特異性雜交瘤細胞的篩選和鑒定
        3.2.4 利用競爭性ELISA驗證VP1單克隆抗體識別表位
        3.2.5 檢測VP1-IgGs對VP1消化的小片段多肽的識別表位
        3.2.6 VP1-IgGs腹水制備與抗體純化
        3.2.7 VP1-IgGs體外中和實驗
        3.2.8 VP1-IgGs協(xié)同中和實驗
        3.2.9 EV71在THP-1細胞中的復制曲線測定
        3.2.10 EV71 VP1-IgGs在THP-1細胞中的對病毒復制的影響
        3.2.11 WesternBlot鑒定EV71-VP1 IgGs識別VP1抗原表位
第4章 結論與展望
    4.1 結論
        4.1.1 EV712A特異性IgA單克隆抗體的篩選及其對病毒復制的影響
        4.1.2 EV71VP1特異性IgG單克隆抗體的篩選及其對病毒復制的影響
    4.2 討論
        4.2.1 關于EV71非結構蛋白作為免疫靶標的選擇
        4.2.2 EV71抗體依賴性增強效應的測定
    4.3 展望
參考文獻
致謝
附錄 常用縮寫
作者簡歷及攻讀學位期間發(fā)表的學術論文與研究成果



本文編號：3505400