本文關(guān)鍵詞：家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)手足口病疫苗EV71的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是一種被馴化和利用5000年之久的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲,在我國農(nóng)業(yè)、工業(yè)及科學(xué)研究中都占有重要的地位。絲腺是家蠶合成和分泌絲蛋白的特化器官,絲蛋白在五齡后期隨核內(nèi)有絲分裂大量合成,以絲狀物形式高效分泌出來,結(jié)成一個重約0.5g的蠶繭。由于具有高效的蠶絲生產(chǎn)能力,加之飼養(yǎng)簡單、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn),家蠶成為合成和生產(chǎn)外源蛋白的理想生物反應(yīng)器。近年來,整個亞太地區(qū),特別在中國手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)的爆發(fā)和流行,嚴(yán)重威脅著這一地區(qū)嬰幼兒的健康。目前針對此病還沒有特別有效的治療藥物,亟需開發(fā)一種抗原譜廣、免疫原性高、安全穩(wěn)定的疫苗,是預(yù)防這一疾病的根本措施。本論文利用含有piggyBac轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)元件的原始質(zhì)粒,構(gòu)建了中部絲腺組織與時空特異表達(dá)手足口病疫苗的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒,采用胚胎顯微注射技術(shù),經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因陽性品系。為了提高外源蛋白的分離純化效率,通過獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品系與絲膠繭突變體Nd-s品系雜交和篩選,我們得到了絲膠繭陽性品系。從個體生長發(fā)育過程和Inverse PCR結(jié)果可知,所轉(zhuǎn)外源基因不影響家蠶幼蟲個體的生長發(fā)育。RT-PCR 和 QPCR的結(jié)果顯示目標(biāo)基因VP1在中部絲腺特異性地高表達(dá)。SDS-PAGE 和 western blotting實(shí)驗進(jìn)一步證明VP1蛋白的成功表達(dá)。在探索VP1蛋白的分離純化條件時,首先通過陽性絲膠繭不同處理時間的實(shí)驗,我們得到絲膠繭的最適處理時間為60h。然后對比濃縮過的正常陽性繭和直接提取的絲膠繭的外源蛋白的提取效率,結(jié)果顯示,每個絲膠繭和正常陽性繭中的VP1蛋白分別為41.7gg和9.8μg。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小,首先將上述兩樣品的總蛋白通過50kd的濃縮柱,再將過濾液通過30kd的濃縮柱,如此重復(fù)濃縮純化3-5次,通過分子篩的原理即可得到比較純凈的VP1蛋白。通過和BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(1、2和5μg)對比,SDS-PAGE結(jié)果顯示,每個絲膠繭和正常陽性繭得到目標(biāo)蛋白分別為500ng和550ng,純度分別為90%和70%。后經(jīng)過ELISA活性檢測,VP1抗原蛋白可以很好地和EV71VLP綜合性抗體和mD5單克隆抗體結(jié)合,顯示出良好的生物活性。以上結(jié)果證明了VP1蛋白成功高效地表達(dá)并分泌到絲膠繭中。為了提高VP1外源蛋白的表達(dá)量,我們嘗試?yán)肅RISPR/Cas9介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù)將VP1和紅色熒光蛋白的表達(dá)框序列定點(diǎn)插入到sericin1基因的翻譯起始位點(diǎn),然后借助serl基因內(nèi)源啟動子活性以及多線染色體的核內(nèi)有絲分裂高效轉(zhuǎn)錄活性,試圖最大可能地提高外源基因的表達(dá)量。我們構(gòu)建了單、雙靶點(diǎn)兩種類型的donor,分別得到GO代蛹期嵌合體20頭和8頭,占蛹總數(shù)的7.14%和5.03%。其中,兩種Donor得到的生殖腺特異的嵌合體占總嵌合體個數(shù)的比例分別為60%和50%。遺憾的是,這些嵌合體沒有成功地通過遺傳轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定遺傳的陽性品系。Cas9/sgRNA切割效率的檢測,結(jié)果顯示兩個位點(diǎn)均有活性,但都不高,這可能沒有得到陽性品系的原因。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 VP1 轉(zhuǎn)基因技術(shù) CRlSPR/Cas9 定點(diǎn)整合
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 緒論11-22
• 1.1 引言11
• 1.2 EV71疫苗的研究進(jìn)展11-12
• 1.3 家蠶生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展12-19
• 1.3.1 家蠶核型多角體病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)13
• 1.3.2 piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因遺傳操作系統(tǒng)13-17
• 1.3.3 家蠶絲腺生物反應(yīng)器的存在的問題分析和發(fā)展趨勢17-19
• 1.4 本項目的研究意義、內(nèi)容及技術(shù)路線19-22
• 1.4.1 研究背景與意義19-20
• 1.4.2 研究內(nèi)容20-21
• 1.4.3 技術(shù)路線圖21-22
• 第二章 轉(zhuǎn)基因家蠶介導(dǎo)的EV71疫苗的表達(dá)研究22-49
• 2.1 引言22
• 2.2 材料與試劑22-26
• 2.2.1 家蠶品系及飼養(yǎng)條件22
• 2.2.2 主要藥品、試劑和試驗儀器22-26
• 2.3 實(shí)驗方法26-42
• 2.3.1 轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建26-34
• 2.3.2 體外轉(zhuǎn)錄Helper mRNA(IFP2)34-35
• 2.3.3 家蠶胚胎顯微注射和熒光篩選方法35-36
• 2.3.4 Inverse PCR檢測插入位點(diǎn)36-37
• 2.3.5 家蠶絲腺RNA提取37
• 2.3.6 RT-PCR和QPCR37-39
• 2.3.7 家蠶活性蛋白的分離純化39-41
• 2.3.8 家蠶活性蛋白的鑒定41-42
• 2.4 結(jié)果分析42-47
• 2.4.1 絲膠繭陽性品系獲得42-44
• 2.4.2 VP1基因在家蠶個體中表達(dá)分析44-45
• 2.4.3 VP1蛋白的分離純化45-47
• 2.4.4 VP1蛋白的活性鑒定47
• 2.5 討論47-48
• 2.6 本章小結(jié)48-49
• 第三章 基于CRISPR/CAS9家蠶基因組編輯技術(shù)的EV71疫苗的表達(dá)研究49-62
• 3.1 引言49
• 3.2 材料與試劑49-50
• 3.2.1 家蠶品系及飼養(yǎng)條件49-50
• 3.2.2 主要藥品、試劑和試驗儀器50
• 3.3 實(shí)驗方法50-57
• 3.3.1 Donor質(zhì)粒的構(gòu)建方法50-52
• 3.3.2 體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA、Sericin1 sgRNAs和Bmku70 dsRNA52-55
• 3.3.3 家蠶胚胎顯微注射和熒光篩選方法55
• 3.3.4 突變體基因組DNA提取以及突變檢測55-57
• 3.4 結(jié)果分析57-60
• 3.4.1 基因組整合位點(diǎn)及Donor載體設(shè)計57
• 3.4.2 蛹期GO代嵌合體紅色熒光的表達(dá)57-58
• 3.4.3 Cas9/sgRNA切割效率的檢測58-60
• 3.5 討論60-61
• 3.6 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 引用文獻(xiàn)63-68
• 致謝68

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊慶賢;;生物反應(yīng)器的放大[J];國外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊;1980年04期

2 童胤;;有內(nèi)部通風(fēng)回路的中空纖維生物反應(yīng)器[J];國外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊;1992年01期

3 譚映軍;空間生物反應(yīng)器的增氧技術(shù)分析[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;1997年01期

4 ;用膀胱作生物反應(yīng)器生產(chǎn)人生長激素的試驗[J];上海實(shí)驗動物科學(xué);1999年01期

5 ;制備生物反應(yīng)器的方法[J];藥物生物技術(shù);2001年01期

6 王洪躍;魏樹源;戴曉云;;生物反應(yīng)器與相關(guān)生物工程探討[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2009年02期

7 ;人體皮膚可用生物反應(yīng)器培養(yǎng)[J];生物學(xué)通報;1996年06期

8 趙弋洋,酆惠芬,宋繼昌;一種新型的生物反應(yīng)器[J];國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊;2001年02期

9 鐘鵬;黃華;楊承凱;張廷芳;;旋轉(zhuǎn)式組織工程生物反應(yīng)器檢測控制及驅(qū)動系統(tǒng)[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2008年01期

10 沈裕康;藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展(續(xù))[J];中成藥研究;1986年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張耀洲;;家蠶生物反應(yīng)器生物制藥研究進(jìn)展[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

2 何家祿;張志芳;;家蠶生物反應(yīng)器的安全性研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

3 賈景明;胡高升;吳春福;;藥用植物細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)研究[A];第八屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會與第五屆全國藥用植物和植物藥學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

4 張嗣良;;細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器多尺度與系統(tǒng)生物學(xué)研究[A];中國生物工程學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2006年

5 周百成;王金霞;;藻類生物反應(yīng)器——原理、應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化策略[A];中國生物工程學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2006年

6 張?zhí)m河;謝維民;汪群慧;夏波;;滴濾塔式生物反應(yīng)器去除硫化氫氣體試驗研究[A];中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會優(yōu)秀論文集（下卷）[C];2006年

7 范秀波;劉天慶;劉洋;葛丹;馬學(xué)虎;;旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器內(nèi)無血清擴(kuò)增臍帶血造血干/祖細(xì)胞[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

8 杜金霞;;生物反應(yīng)器在分子水平的應(yīng)用與研究[A];中國生物工程學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2006年

9 王大帥;高麗蘭;門玉濤;李江;劉海英;張春秋;董心;;一種組合式多功能施載生物反應(yīng)器的設(shè)計[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三十三屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

10 貢成良;薛仁宇;曹廣力;沈衛(wèi)德;;家蠶生物反應(yīng)器[A];中國蠶學(xué)會第四屆青年學(xué)術(shù)研討會會議論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 國家生化工程技術(shù)研究中心(上海) 張嗣良;我國生物反應(yīng)器制造水平亟待提高[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 善成;人乳鐵蛋白奶牛生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)化項目落戶無錫新區(qū)[N];中國食品報;2011年

3 記者 沐滟;專家齊聚論道生物產(chǎn)業(yè)前沿[N];無錫日報;2011年

4 記者沐滟;無錫立潮頭打造百億級新產(chǎn)業(yè)[N];無錫日報;2011年

5 記者 丁寧 實(shí)習(xí)生 尹健;用植物表達(dá)藥物 建安全活體藥廠[N];長春日報;2006年

6 記者　王暉;我省生物反應(yīng)器獲美國專利[N];河南日報;2006年

7 記者沐滟;打造生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高地[N];無錫日報;2011年

8 朱品昌　盛仲平 呂丹;無錫打造一流生物制藥產(chǎn)業(yè)基地[N];江蘇經(jīng)濟(jì)報;2011年

9 學(xué)生記者 潘正道　成書冉 胡雨寒;降低膜能耗 污水化資源[N];新清華;2010年

10 李炎、王小勝、鄭又群;國內(nèi)首臺蚯蚓生物反應(yīng)器在我省研制成功[N];河北日報;2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馮偉;氣液兩相流生物反應(yīng)器流動與降酚特性動態(tài)行為研究[D];天津大學(xué);2006年

2 周志瑋;動物細(xì)胞生物反應(yīng)器關(guān)鍵技術(shù)研究及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2012年

3 賈曉強(qiáng);氣液固三相生物反應(yīng)器流動與降酚特性動態(tài)行為研究[D];天津大學(xué);2009年

4 吳松維;填埋垃圾生物反應(yīng)器反硝化性能及反硝化微生物研究[D];浙江大學(xué);2010年

5 王然;新型復(fù)合生物反應(yīng)器[D];吉林大學(xué);2007年

6 龍焰;生活垃圾快速降解并原位脫氮的生物反應(yīng)器填埋技術(shù)及機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2008年

7 王捷;浸沒式膜—生物反應(yīng)器運(yùn)行工況及系統(tǒng)設(shè)計的優(yōu)化研究[D];天津大學(xué);2007年

8 曹斌;復(fù)合生物反應(yīng)器—膜分離技術(shù)處理城市污水的試驗研究[D];西安建筑科技大學(xué);2005年

9 王雪;氣升式三相環(huán)流生物反應(yīng)器脫臭性能和優(yōu)化模擬[D];天津大學(xué);2010年

10 王東芳;內(nèi)置雙重安全控制機(jī)制的水稻生物反應(yīng)器表達(dá)藥物蛋白質(zhì)[D];浙江大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 安笑輝;錯位槳攪拌生物反應(yīng)器流場特性及溶氧性能研究[D];山東大學(xué);2015年

2 郄龍飛;高通量微型生物反應(yīng)器關(guān)鍵技術(shù)研究[D];北京化工大學(xué);2015年

3 徐銳;振蕩流動條件下組織再生過程的數(shù)值模擬及流場參數(shù)對組織增長影響的研究[D];武漢紡織大學(xué);2015年

4 劉唯;載體曝氣生物反應(yīng)器處理低溫生活污水研究[D];華北理工大學(xué);2015年

5 廖澤君;基于海藻酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠包埋技術(shù)制備微生物氧化劑的研究[D];南華大學(xué);2015年

6 潘康明;第二代新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器的研制與應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

7 李志偉;Zn(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)協(xié)同作用對序批式生物反應(yīng)器性能的影響[D];中國海洋大學(xué);2015年

8 喬宏雷;生物反應(yīng)器（VERO細(xì)胞）培養(yǎng)森腦病毒工藝的摸索[D];吉林大學(xué);2016年

9 劉紫冰;一次性生物反應(yīng)器和過濾澄清系統(tǒng)在重組抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用[D];北京理工大學(xué);2015年

10 李小衛(wèi);家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)手足口病疫苗EV71的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)手足口病疫苗EV71的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：350027