目的構(gòu)建及鑒定卡介苗（BCG）和毒株H37Rv Hsp16.3基因突變株,觀察該突變株對小鼠巨噬細(xì)胞自噬功能的影響,為研究結(jié)核分枝桿菌潛伏感染形成的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。方法分別培養(yǎng)BCG和毒株H37Rv,提取BCG和毒株H37Rv的基因組DNA。設(shè)計(jì)兩對引物,分別以BCG基因組/毒株H37Rv的基因組為模板,通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的方法擴(kuò)增出分子量為435 bp的Hsp16.3基因以及該基因兩側(cè)分子量分別為663 bp和684 bp的兩個DNA片段,后分別插入到p KO載體上相應(yīng)的位點(diǎn),通過硫酸卡那霉素篩選,利用PCR擴(kuò)增,雙酶切以及測序的方法,篩選出陽性重組質(zhì)粒p KO-Hsp16.3;根據(jù)同源重組的原理,應(yīng)用電轉(zhuǎn)化的方法,將陽性重組質(zhì)粒p KO-Hsp16.3電轉(zhuǎn)入BCG和毒株H37Rv的感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過硫酸卡那霉素和蔗糖兩次篩選,得到BCG和毒株H37Rv Hsp16.3基因突變株。繪制細(xì)菌OD值與菌落形成單位（CFU）相關(guān)性曲線,并根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌濃度確定感染菌落數(shù)。將篩選培養(yǎng)的BCG Hsp16.3突變株用于小鼠巨噬細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn),并通過Western Blot和細(xì)胞免... 

【文章來源】：成都醫(yī)學(xué)院四川省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 卡介苗和毒株H37RV的HSP16.3 基因突變株的構(gòu)建與鑒定
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與耗材
        1.2 主要試劑
        1.3 主要溶液的配置
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 HSP16.3 基因，HSP16.3 基因的 5' 端和的 3' 端基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        2.2 引物的設(shè)計(jì)和合成
        2.3 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出HSP16.3 基因及HSP16.3 基因 5' 端和 3' 端序列
        2.4 重組質(zhì)粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的構(gòu)建與鑒定
        2.5 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3-5' 的構(gòu)建和鑒定
        2.6 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3 的構(gòu)建和鑒定
        2.7 重組質(zhì)粒 pKO-Hsp16.3 的測序
        2.8 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突變株的構(gòu)建
        2.9 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突變株的鑒定
        2.10 正常BCG和毒株H37RV與BCG和H37RV的HSP16.3 基因突變株的形態(tài)
    3 結(jié)果
        3.1 HSP16.3 基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
        3.2 HSP16.3 基因 5' 端和 3' 端目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
        3.3 重組質(zhì)粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的雙酶切鑒定結(jié)果
        3.4 重組質(zhì)粒 18T-HSP16.3-5' 和 18T-HSP16.3-3' 的測序結(jié)果
        3.5 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3-5' 的雙酶切鑒定結(jié)果
        3.6 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3/PST I+HIND III的雙酶切鑒定結(jié)果
        3.7 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3 HSP16.3 基因的 5' 端和 3' 端目的片段的PCR鑒定結(jié)果
        3.8 重組質(zhì)粒PKO-HSP16.3 中HSP16.3 基因的 5' 端和 3' 端基因序列的測序結(jié)果
        3.9 BCG和毒株H37RV HSP16.3 基因突變株經(jīng)硫酸卡那霉素篩選結(jié)果
        3.10 BCG 和毒株 H37Rv Hsp16.3 基因突變株的 Kana 基因菌液 PCR篩選結(jié)果
        3.11 BCG和H37RV HSP16.3 基因突變株培養(yǎng)液PCR篩選結(jié)果
        3.12 結(jié)核分枝桿菌抗酸染色結(jié)果
    4 討論
第二部分BCG HSP16.3 基因突變株對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 自噬功能的影響
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與耗材
        1.2 主要試劑
        1.3 主要溶液的配制
    2 方法
        2.1 HSP16.3 基因突變株CFU計(jì)數(shù)
        2.2 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 的傳代、凍存及復(fù)蘇
        2.3 HSP16.3 基因突變株對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 自噬功能的影響
        2.4 BCG HSP16.3 基因突變株對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 自噬影響的共聚焦檢測
    3 結(jié)果
        3.1 BCG HSP16.3 基因突變株CFU計(jì)數(shù)結(jié)果
        3.2 雷帕霉素在24H內(nèi)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 發(fā)生自噬的WESTERN BLOT結(jié)果
        3.3 3-MA對雷帕霉素誘導(dǎo)自噬發(fā)生的最適抑制濃度
        3.4 BCG HSP16.3 基因突變株對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 自噬影響的WESTERNBLOT結(jié)果
        3.5 BCG HSP16.3 基因突變株影響小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 自噬功能的激光共聚焦結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄一
附錄二
攻讀碩士學(xué)位期間研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3458184