第一部分風(fēng)疹病毒E72-296亞單位疫苗的制備和有效性評價研究背景風(fēng)疹病毒（Rubella virus, RV）是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員,為單股正鏈的RNA病毒,通常在一般人群中引起溫和的疾病,但孕婦感染RV能導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或胎兒出生缺陷,即先天風(fēng)疹綜合征（Congenital rubella syndrome,CRS）。目前使用的RV疫苗均為減毒活疫苗,接種孕婦存在安全隱患,接種AIDS兒童和免疫缺陷人群可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。風(fēng)疹基因工程亞單位疫苗由于其安全性高于減毒活疫苗,可接種孕婦、AIDS兒童和免疫缺陷人群,是目前風(fēng)疹疫苗的研究熱點。RV的E1蛋白是RV的包膜糖蛋白,分子上包含重要的T細(xì)胞、B細(xì)胞和抗體中和表位,在動物體內(nèi)能夠引起體液免疫和一定的細(xì)胞免疫。E1蛋白上含有四個中和抗體表位,分別是E1（221-239）, E1（234-252）, E1（254-285）和E1（272-285）。其中,E1（221-239）被認(rèn)為是主要的中和表位,E1（272-285）被認(rèn)為含有T細(xì)胞表位和誘導(dǎo)中和抗體的表位。有多個研究用原核、畢赤酵母和CHO細(xì)胞等系統(tǒng)表達(dá)了包含這些表位的E1... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

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畢赤酵母菌密碼子利用率圖

了畢赤酵母菌的密媽子利用率情況）對E1蛋白胞外E (E,-446)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化方案由上海生工完成，優(yōu)化基因的密碼子利用率如圖2,去除了表達(dá)率小于10%的密碼子，增加了畢赤酵母菌利用密碼子的頻率，為構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因建立了優(yōu)化基因模板。Jlf jJL li—s § s f a ti a a Y ^ t § ? y ￥ a a s S s s stM-J—■MWIIll I ? i■丨…Willi I ■■ I gA llllllllll ^ Ml—I iL ^llWIMIWW； L1 r I |>--^ p-*y>l 1<3?o -r?C3 Oct -an ■? 03 oa "O-a?rt-si ■OKJ -oai -sfcca -a -=?3 oa -sja- 1=1 廠 "I I?' ！^“丨 i 1? 丨’‘‘'I? 3 m 發(fā)努至 ：發(fā)—g § g ？ S ？ § S f S ^ S ？ § J ^ S ^ S ？|'1 I ‘ ‘ '| V Vf-, "ifrrHlTV^ r圖1畢赤酵母菌密碼子利用率圖50

GACCTTAT基因測序結(jié)果與目標(biāo)片段序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)兩者完全吻合，表明PZaA-E72-:!%、pGAPZaA-E72-304、pGAPZaA-E25-304 和 pGAPZaA-E25-395 表達(dá)構(gòu)建成功，可以進(jìn)行蛋白表達(dá)。(四）E72-2%重組蛋白在畢赤酵母菌分泌上清中的表達(dá)取Zeocin蹄選陽性克隆，接種于1 L改良YPD培養(yǎng)基中，300 r/min搖床，每天取培養(yǎng)液15 ml，4 °C , 10000 r/min離心10 min,將10 m丨上清濃縮后取20|al濃縮樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。如圖4所示，￡72-2%重組蛋白隨達(dá)時間的延長表達(dá)量增加，從6天開始雜蛋白表達(dá)量增加。取5天濃縮樣行SDS-PAGE和Western blot檢測，E72-296重組蛋白能與抗RV E1抗體特異，E72-304、E25-304和E25-395重組蛋白未能在上清中表達(dá)(圖5)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在外源基因表達(dá)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 張伍魁,范清林,宋禮華.  中國生物工程雜志. 2006(01)
[2]風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 吳冰,王志玉.  病毒學(xué)報. 2005(05)
[3]風(fēng)疹病毒JR23株糖蛋白E1在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和抗原性分析[J]. 溫紅玲,王志玉,宋艷艷,任桂杰,陶澤新,宋紹霞,王桂亭,許洪芝.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2005(03)
[4]乳酸菌源有機(jī)硒對肝損傷小鼠脾臟脂質(zhì)過氧化和NK細(xì)胞活性的保護(hù)效應(yīng)研究[J]. 陳龍,朱善良,曹萌.  實驗生物學(xué)報. 2005(01)
[5]風(fēng)疹病毒分子流行病學(xué)研究[J]. 薛永磊,王志玉,王小凡.  中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志. 2004(04)
[6]風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白E1酵母表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 溫紅玲,王志玉,王戰(zhàn)勇,任桂杰.  山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2004(05)
[7]風(fēng)疹病毒分子生物學(xué)與基因工程疫苗研究進(jìn)展[J]. 溫紅玲,王志玉.  國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊). 2004(01)
[8]風(fēng)疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆與序列分析[J]. 王志玉,薛永磊,王小凡,宋艷艷.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2002(06)
[9]外周血淋巴細(xì)胞攜帶風(fēng)疹抗原與中樞神經(jīng)感染風(fēng)疹病毒的關(guān)系[J]. 姚蘋,宋艷艷,許洪芝,王桂亭,劉言訓(xùn),王志玉.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2000(05)
[10]乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的組成型表達(dá)[J]. 周則迅,袁漢英,何煒,高卜渝,李育陽.  復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2000(03)



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