本文關(guān)鍵詞：SFTSV核酸檢測試劑盒國家參考品的研制和乙型腦炎病毒E蛋白的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核酸檢測試劑盒國家參考品的研制【目的】發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(SFTSV)是首次在中國出現(xiàn)并由國內(nèi)專家分離到的一種新病毒,病死率高達(dá)10%。目前針對該病毒尚無有效的疫苗和藥物。為了有效控制該疾病傳播,對其快速、準(zhǔn)確診斷是基礎(chǔ)。市場上出現(xiàn)了各種檢測試劑盒,但尚無關(guān)于SFTSV檢測試劑盒的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品。為了對此類試劑盒等進(jìn)行科學(xué)有效的質(zhì)量控制,本文研制了SFTSV核酸檢測試劑盒的國家參考品�！痉椒ā勘狙芯堪凑諊覅⒖计方⒌南嚓P(guān)規(guī)定和SFTSV的生物學(xué)特點(diǎn),分別篩選出符合要求的陽性參考品和陰性參考品,并通過測序驗(yàn)證和熒光定量PCR驗(yàn)證進(jìn)行確認(rèn),確保參考品的準(zhǔn)確性和特異性。在此基礎(chǔ)上,將陽性參考品HB29株病毒系列稀釋,以此考察試劑盒的最低檢出限,從而確定參考品的靈敏度,并通過檢測稀釋至104U/mL的HB29株病毒Ct值的變異系數(shù)來確定參考品的精密度。本研究建立的參考品已組織不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定,以確定參考品的特性值。參考品完成之后進(jìn)行不同溫度和反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),考察參考品的穩(wěn)定性。【結(jié)果】根據(jù)參考品應(yīng)具有的廣譜性和代表性最終確定了6株陽性參考品和5株陰性參考品,基因測序和熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均證明了參考品的準(zhǔn)確性。通過對SFTSV HB29株病毒系列稀釋后的最低檢出限實(shí)驗(yàn),結(jié)合臨床上病人血清的病毒載量,確定102U/mL的病毒量作為參考品的最低檢出限,即含量為102U/mL必須檢測為陽性,低于102U/mL不作要求。結(jié)合各個(gè)試劑盒的檢測結(jié)果,確定本精密度參考品的Ct值的變異系數(shù)應(yīng)不高于5.0%。協(xié)作標(biāo)定各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本參考品在不同溫度和反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性良好。目前本參考品已通過國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會批準(zhǔn),作為SFTSV核酸檢測試劑盒國家第一代參考品,其批準(zhǔn)文號為:(2015)國生參字0065�！窘Y(jié)論】本研究建立了SFTSV核酸檢測試劑盒國家參考品,填補(bǔ)了國內(nèi)尚無SFTSV相關(guān)參考品的空缺,能夠?qū)z測試劑盒進(jìn)行良好的質(zhì)量控制,保證試劑盒能快速準(zhǔn)確地檢測出病人血清中的SFTSV,從而更加科學(xué)有效的促進(jìn)SFTSV的預(yù)防控制工作。第二部分乙型腦炎病毒E蛋白的研究【目的】乙型腦炎(JE)減毒活疫苗SA14-14-2是我國自主研發(fā)的一種疫苗,對乙腦的流行和控制起著重要作用,自投產(chǎn)以來在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。為了從分子、原子水平探討乙型腦炎減毒株SA14-14-2弱毒力穩(wěn)定、免疫原性良好的理論基礎(chǔ),解析JEV SA14-14-2蛋白中與病毒毒力和免疫原性相關(guān)的病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過原核表達(dá)獲得乙腦病毒E蛋白,通過X射線衍射技術(shù),對該蛋白晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,結(jié)合不同的乙腦病毒E蛋白的生物學(xué)功能,探索JEV SA14-14-2的免疫原性和減毒機(jī)理�！痉椒ā勘狙芯繉⒃吮磉_(dá)載體p QE C3與乙腦病毒E基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,驗(yàn)證正確后導(dǎo)入到受體菌BL21內(nèi),以IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),高壓破碎細(xì)菌后收獲E蛋白包涵體。再通過鎳柱親和層析、折疊復(fù)性和凝膠過濾層析對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。獲得的目的蛋白一部分用于晶體結(jié)構(gòu)解析,另一部分以不同劑量(80μg/只、120μg/只)免疫Balb/c小鼠,分別進(jìn)行免疫攻擊保護(hù)力實(shí)驗(yàn)和血清中和抗體檢測,以解析其生物學(xué)功能。【結(jié)果】原核表達(dá)載體p QE C3與乙腦病毒包膜糖蛋白E基因連接完成,獲得了重組載體,轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21內(nèi),并鑒定正確,獲得了陽性克隆。用LB培養(yǎng)基培養(yǎng),IPTG誘導(dǎo)后收獲目的蛋白包涵體,經(jīng)過復(fù)性、純化后獲得JEV SA14-14-2、SA14-5-3、SA14-9-7 E蛋白,其中一部分蛋白用于E蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析,獲得了晶體。另一部分進(jìn)行E蛋白免疫原性研究,結(jié)果顯示,SA14-14-2 E蛋白免疫后中和抗體水平最高,達(dá)1:23,血清陽轉(zhuǎn)率達(dá)100%。中和抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)率高低趨勢均為SA14-14-2SA14-5-3SA14-9-7,與三株病毒原型株的免疫原性高低趨勢相符。E蛋白保護(hù)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組蛋白均呈現(xiàn)出一定的保護(hù)力,但差異不明顯�！窘Y(jié)論】本研究通過原核表達(dá)收獲乙型腦炎病毒E蛋白,為深入研究該蛋白生物學(xué)功能和晶體結(jié)構(gòu)解析提供了條件,進(jìn)一步為解析乙腦病毒的致病機(jī)理、乙腦減毒活疫苗毒株SA14-14-2的減毒機(jī)理和疫苗的質(zhì)量控制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。SA14-14-2 E蛋白的中和抗體水平結(jié)果表明其蛋白的免疫原性高于SA14-5-3和SA14-9-7,這與三株病毒的免疫原性下降趨勢相符,推測E蛋白是影響乙腦病毒的免疫原性改變的關(guān)鍵蛋白。由于三組蛋白的免疫保護(hù)力差異不明顯推測病毒的致病機(jī)理可能還與其他非結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：SFTSV 熒光定量 PCR 核酸檢測試劑盒 參考品乙型腦炎病毒 原核表達(dá) 蛋白純化 免疫原性 晶體解析
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一部分SFTSV核酸檢測試劑盒國家參考品的研制10-52
• 前言10-12
• 材料和方法12-26
• 1、實(shí)驗(yàn)材料12-13
• 2、實(shí)驗(yàn)方法13-26
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-49
• 1、陽性參考品的建立26-31
• 2、陰性參考品的建立31-36
• 3、靈敏度參考品的確定36-40
• 4、精密度參考品的確定40-42
• 5、研究儀器選用說明42
• 6、參考品的協(xié)作標(biāo)定42
• 7、參考品的穩(wěn)定性研究42-49
• 討論49-51
• 總結(jié)51-52
• 第二部分 乙型腦炎病毒E蛋白的研究52-88
• 前言52-55
• 材料和方法55-66
• 1、材料55-57
• 2、實(shí)驗(yàn)方法57-66
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-84
• 1、乙型腦炎病毒E蛋白的表達(dá)66-73
• 2、乙型腦炎病毒E蛋白的純化73-79
• 3、免疫攻擊保護(hù)力實(shí)驗(yàn)79-80
• 4、血清中和抗體水平80-82
• 5、晶體結(jié)構(gòu)解析82-84
• 討論84-87
• 總結(jié)87-88
• 參考文獻(xiàn)88-94
• 英文縮略詞94-96
• 附錄96-97
• 發(fā)表文章97-98
• 致謝98

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 侯爵;劉穎;邵一鳴;;黃熱病毒的基因組及其蛋白研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2011年04期

2 郭楊;陳世界;郭萬柱;李t

本文編號：327105