本文關(guān)鍵詞：抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰島素是生物體內(nèi)非常重要的降糖激素,它是糖尿病診斷、糖尿病相關(guān)研究及糖尿病治療藥物研發(fā)等過程中重要的檢測指標和研究靶點。因此,檢測胰島素水平是必需的技術(shù)要求。目前,用于檢測胰島素含量的方法大都基于抗原抗體特異性反應(yīng)的原理,因此制備高效、特異的抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體是建立胰島素檢測方法的重要基礎(chǔ)。在本研究中,我們制備了抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體,并對抗體的特性進行初步研究,得到以下結(jié)果。1.檢測抗胰島素抗體水平的間接ELISA方法條件的優(yōu)化。在進行陽性克隆篩選前我們要對測定抗體水平的間接ELISA方法的條件進行優(yōu)化。本研究中我們分別從抗原包被濃度、小鼠血清稀釋比例、封閉液種類、封閉時間、血清作用時間、酶標抗體稀釋比例和孵育時間等反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如下:抗原最佳包被濃度為5μg/mL,小鼠血清最優(yōu)稀釋比例為1:100,最佳封閉液為1%BSA,其最優(yōu)封閉時間為2 h,血清最佳作用時間為1.5 h,酶標抗體最佳稀釋比例為1:6000,其最優(yōu)作用時間為30 min。2.抗胰島素單克隆抗體的制備。首先,我們用商品化的豬胰島素作為抗原,采用背部多點注射和腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。三次免疫后,通過間接ELISA方法檢測小鼠血清效價,優(yōu)先選擇效價高的小鼠進行加強免疫。然后在加強免疫后3天處死小鼠,無菌取脾,獲得的脾細胞與處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞或者NS-1細胞通過化學(xué)試劑聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合。本研究中總共進行了4次細胞融合,經(jīng)篩選和亞克隆,最后獲得三株陽性雜交瘤細胞,分別為2D7、4D4和5D12。經(jīng)Mouse單抗亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型全為IgM型,輕鏈為Kappa。通過體內(nèi)誘生的方法產(chǎn)生大量單克隆抗體,經(jīng)測定,2D7、4D4、5D12腹水效價分別為1:3200、1:51200和1:12800。利用優(yōu)球蛋白純化法得到初純抗體。最后,我們鑒定了抗體的特異性和交叉反應(yīng)性。ELISA檢測結(jié)果顯示,三種單克隆抗體均與牛胰島素發(fā)生交叉反應(yīng)。Western blot實驗結(jié)果提示,三種抗體可能識別胰島素的構(gòu)象性表位,而非線性表位。3.抗胰島素多克隆抗體的制備。我們用商品化的豬胰島素和牛胰島素分別作為抗原,采用背部多點注射和腹腔注射的方式免疫豚鼠。一共免疫4次,最后免疫5天后,采用心臟取血的方法收集大量血清。利用間接ELISA方法測定血清效價,抗原為豬胰島素的豚鼠血清效價為1:25600,抗原為牛胰島素的豚鼠血清最高效價為1:51200。經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后,成功獲得粗純的多克隆抗體。隨后我們鑒定了抗體的特異性和交叉反應(yīng)性。ELISA檢測結(jié)果顯示,抗豬胰島素多克隆抗體能與牛胰島素發(fā)生交叉反應(yīng),且抗牛胰島素多克隆抗體與豬胰島素也能發(fā)生交叉反應(yīng)。Western blot實驗結(jié)果顯示,兩種多克隆抗體均能與豬胰島素和牛胰島素特異性結(jié)合。綜上所述,我們成功地獲得了3株分泌抗胰島素單克隆抗體的雜交瘤細胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體,同時也成功地制備出抗胰島素多克隆抗體,并對抗體特性進行了初步研究,為實驗室自行建立胰島素水平的檢測方法提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胰島素 單克隆抗體 多克隆抗體 ELISA Western blot
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-11
• 第一部分 文獻綜述11-20
• 一、胰島素及其應(yīng)用11-12
• （一）胰島素的分子結(jié)構(gòu)11
• （二）胰島素的生物學(xué)功能及應(yīng)用11-12
• 二、胰島素檢測手段12-15
• （一）放射免疫分析法12
• （二）免疫放射分析法12-13
• （三）酶聯(lián)免疫分析法13
• （四）熒光免疫分析法13-14
• （五）化學(xué)發(fā)光免疫分析法14
• （六）其他新型的檢測技術(shù)14-15
• 三、抗體的研究進展及其應(yīng)用15-19
• （一）抗體制備技術(shù)15-17
• （二）抗體研究進展17-18
• （三）抗體的應(yīng)用18-19
• 四、本課題研究的目的與意義19-20
• 第二部分 材料與方法20-32
• 一、實驗材料20-25
• （一）實驗儀器及器材20
• （二）實驗動物及細胞系20
• （三）實驗試劑20-21
• （四）主要溶液配制21-25
• 二、實驗方法25-32
• （一）細胞培養(yǎng)相關(guān)實驗方法25
• （二）間接ELISA25-26
• （三）抗胰島素單克隆抗體制備26-28
• （四）抗胰島素多克隆抗體制備28-29
• （五）SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍染色29-30
• （六）抗體特性鑒定30-32
• 第三部分 實驗結(jié)果32-48
• 一、不同物種來源的胰島素蛋白質(zhì)序列對比32-33
• 二、檢測抗體水平的間接ELISA方法條件的優(yōu)化33-37
• （一）檢測抗胰島素單抗的間接ELISA方法最佳工作條件的確立33-36
• （二）檢測抗胰島素多抗的間接ELISA方法最佳工作條件的確立36-37
• 三、抗胰島素單克隆抗體制備37-44
• （一）小鼠加強免疫前小鼠血清效價測定37-38
• （二）細胞融合38-39
• （三）陽性克隆檢測、篩選及亞克隆39-41
• （四）單抗亞型鑒定41
• （五）單抗腹水制備及效價檢測41-42
• （六）單抗純化42-43
• （七）單抗交叉反應(yīng)性分析43-44
• 四、抗胰島素多克隆抗體制備44-48
• （一）免疫動物血清效價測定44-45
• （二）多抗純化45
• （三）多抗純化后效價測定45-46
• （四）多抗交叉反應(yīng)性分析46-48
• 第四部分 討論48-52
• 第五部分 結(jié)論52-53
• 參考文獻53-58
• 英文縮寫詞58-59
• 致謝59-60
• 作者簡介60

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本文編號：312442