發(fā)布時(shí)間：2021-01-18 08:47

　　提出了一種多重巢式固相PCR的方法,以微流控芯片為載體,采用紫外交聯(lián)方式將寡核苷酸序列固定在芯片上,構(gòu)建了陣列式固相PCR-陣列（PCR-Array）芯片,用于細(xì)菌和病毒類高致病性病原微生物的并行檢測。選擇新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌和布魯氏菌4種代表性高致病性病原微生物為研究對象,通過基因工程手段構(gòu)建了包含有炭疽桿菌和布魯氏菌特異性基因片段的重組質(zhì)粒載體,利用病毒包裝技術(shù)構(gòu)建了包含有兩種病毒特異性基因片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒,完成了4種高致病性病原微生物陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備,并以此作為實(shí)驗(yàn)樣本,探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制備方法和擴(kuò)增體系。結(jié)果表明,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種高致病性病原微生物的檢出限達(dá)10 copy/μL以下量級。本方法靈敏度高,特異性好,同時(shí),引物空間上的隔離避免了相互干擾,提高了檢測通量,在多種病原微生物快速并行檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。 

【文章來源】：分析化學(xué). 2019,47(11)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

多重巢式固相PCＲ-Array芯片檢測原理圖:(A)多重巢式固相PCＲ體系組成:細(xì)菌DNA、病毒ＲNA、游離上下游引物、固相引物;(B)多重巢式固相PCＲ擴(kuò)增第一階段，游離上下游引物優(yōu)先與模板

圖2(A)100μmol/L引物濃度，不同紫外交聯(lián)時(shí)間下，經(jīng)固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后，產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的變化;(B)引物濃度為50μmol/L和100μmol/L時(shí)，紫外交聯(lián)時(shí)間與擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度間關(guān)系Fig．2(A)ChangeoffluorescenceintensityofthesolidＲT-PCＲproductwiththetimeofultravioletcross-linkingat100μmol/Lsolidprimer;(B)Fluorescenceintensityoftheamplifiedproductsversustimeofultravioletcross-linkingat50μmol/Land100μmol/Lsolidprimers相PCＲ方法中，液相引物以一定比例存在于PCＲ反應(yīng)體系中;若液相上下游引物比值過高，說明上游引物過多，而帶有熒光標(biāo)記的下游引物較少，在巢式固相PCＲ的第二階段中，上游引物會競爭抑制固相引物與模板的結(jié)合，因此影響第二階段的擴(kuò)增效率;若液相上下游引物比值過低，則直接影響第一階段液相PCＲ擴(kuò)增效率，使得第一階段擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，影響巢式固相PCＲ終產(chǎn)物數(shù)量。另外，由于固相PCＲ是通過檢測固定點(diǎn)的熒光信號實(shí)現(xiàn)待測目標(biāo)的判定，因此，固相引物濃度直接影響了巢式固相PCＲ方法的檢出限。本研究將濃度為25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的ＲNA為模板，在游離液相上下游引物濃度比值分別是1∶4和1∶2條件下，經(jīng)巢式固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后，比較不同引物濃度組合下，芯片上固定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。如圖3A所示，當(dāng)液相上下游引物濃度比值為1∶4時(shí)，隨著固相引物濃度的持續(xù)升高時(shí)，經(jīng)固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后，熒光強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)，在固相引物濃度為100μmol/L時(shí)達(dá)到最大值;但隨著引物濃度持續(xù)增加(100～150μmol/L)，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢，這表明持續(xù)增加固相引物濃度不能提高固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增效率及擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量。因此，本研究確定固相引物最適濃度為100μmol/L。圖3(A)游離引物?

蔚睦┰魴??若液相上下游引物比值過低，則直接影響第一階段液相PCＲ擴(kuò)增效率，使得第一階段擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，影響巢式固相PCＲ終產(chǎn)物數(shù)量。另外，由于固相PCＲ是通過檢測固定點(diǎn)的熒光信號實(shí)現(xiàn)待測目標(biāo)的判定，因此，固相引物濃度直接影響了巢式固相PCＲ方法的檢出限。本研究將濃度為25～150μmol/L的引物固定在芯片表面，以5．62×104copy/μL埃博拉病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的ＲNA為模板，在游離液相上下游引物濃度比值分別是1∶4和1∶2條件下，經(jīng)巢式固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后，比較不同引物濃度組合下，芯片上固定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。如圖3A所示，當(dāng)液相上下游引物濃度比值為1∶4時(shí)，隨著固相引物濃度的持續(xù)升高時(shí)，經(jīng)固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后，熒光強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)，在固相引物濃度為100μmol/L時(shí)達(dá)到最大值;但隨著引物濃度持續(xù)增加(100～150μmol/L)，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢，這表明持續(xù)增加固相引物濃度不能提高固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增效率及擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量。因此，本研究確定固相引物最適濃度為100μmol/L。圖3(A)游離引物濃度比值F∶Ｒ=1∶4時(shí)，不同固定引物濃度，經(jīng)巢式固相ＲT-PCＲ擴(kuò)增后的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度變化;(B)游離引物F∶Ｒ分別是1∶4和1∶2時(shí)，固定引物濃度與擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度間關(guān)系Fig．3(A)Withconcentrationratioofliquidprimerof1∶4，fluorescenceintensityofsolidＲT-PCＲproductatdifferentconcentrationsofsolidsupportprimer;(B)EffectofconcentrationofsolidprimerandliquidprimeronSP-PCＲ同時(shí)，在游離液相上下游引物濃度比值分別是1∶4和1∶2條件下(圖3B)，當(dāng)固相引物濃度較低時(shí)(＜100μmol/L)，液相上下游引物濃度比值為1∶2的反應(yīng)體系擴(kuò)增效率更高，固定點(diǎn)熒光強(qiáng)度較高;但第11期朱燦燦等:多重巢式固相PCＲ-Array芯片用于高致病性病原微生物并行檢測5571

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]TaqMan-LNA探針多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測炭疽芽胞桿菌的研究[J]. 劉東立,李文涓,石一,張錚,馬國柱,張恩民,李偉.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(03)
[2]布魯氏菌病與炭疽病多重PCR方法的建立[J]. 豆玲,賀奮義,周峰,豆思遠(yuǎn),張登基,郭慧琳.  畜牧獸醫(yī)雜志. 2017(02)
[3]微流控芯片分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室[J]. 林炳承,秦建華.  高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào). 2009(03)
[4]微流控芯片實(shí)驗(yàn)室及其功能化[J]. 林炳承.  中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2003(01)



本文編號：2984648