Lrtm1基因在成肌分化過程中的功能探索
發(fā)布時間：2021-01-13 07:03
目的:觀察成肌分化過程中C2C12細胞Lrtm1表達;構建小鼠Lrtm1慢病毒過表達載體;篩選穩(wěn)定表達外源Lrtm1細胞株誘導其分化后觀察對成肌分化標志基因Myogenin、Myosin的影響;發(fā)現Lrtm1蛋白質表達水平受調控的機制。方法:誘導C2C12細胞分化用Hoechst染色細胞核;將小鼠Lrtm1基因連接到慢病毒載體質粒pLJM1-GFP上并進行慢病毒包裝;篩選穩(wěn)定過表達Lrtm1基因的C2C12細胞系,誘導分化Lrtm1-DDK組、GFP組檢測對成肌分化標志基因Myogenin、Myosin表達的影響;MG132處理C2C12-Lrtm1-DDK細胞系后,觀察內源性Lrtm1蛋白質表達。結果:誘導分化過程中,肌管形成,Lrmt1、Myosin mRNA水平隨分化的進行表達上升;成功構建重組pLJM1-Lrtm1-DDK表達載體;成功篩選穩(wěn)定表達外源Lrtm1細胞株;誘導穩(wěn)定細胞系分化后,real-time PCR在144 h時顯示Lrtm1-DDK組（272.1±18.22）Myogenin mRNA水平較GFP組（332.41±41.21）減少（P<0.05）;Lr...
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學學報. 2018,43(10)北大核心
【文章頁數】：7 頁
【部分圖文】：
kb1kb1234567891011B.pLJM1-GFP載體酶切電泳
s；55℃20s；60℃5s；40個循環(huán)。重復3次實驗，使用2-△△Ct計算相對mRNA含量，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內參基因GAPDH），△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組），2-△△Ct表示實驗組目的基因mRNA含量相對對照組改變的倍數。各基因引物序列見表1。1.2.3重組質粒的構建為進一步研究Lrtm1基因在成肌分化過程中的作用，本研究決定構建穩(wěn)定過表達Lrtm1的細胞株。將目的基因Lrtm1進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，電泳結果顯示，PCR擴增產物的長度為1164bp，與理論計算長度相同（圖1A）。pLJM1-GFP載體用AgeⅠ、EcoRⅠ內切酶（37℃，60min）酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示pLJM1載體雙酶切后出現的各個片段與理論計算的條帶相符（圖1B）。連接轉化后挑選8個單克隆菌落進行菌液PCR，實驗結果表明1~6號，8號克隆成功連接Lrtm1基因（圖1C）。表1各基因引物序列基因引物序列序列長度（bp）Lrtm1DDKMyogeninMyosinGAPDHF：5-TGTTGAATGAGGGTTTGTGCT-3R：5-TCCACGGAGTTTGATGATGG-3F：5-TGAGAAGATGGGAAGTAAGG-3R：5-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGT-3F：5-CTGACCCTACAGACGCCCAC-3R：5-TGTCCACGATGGACGTAAGG-3F：5-CCAAGGGCCTGAATGAGGAG-3R：5-GCAAAGGCTCCAGGTCTGAG-3F：5-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3R：5-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTTG-31391421621531501：Marker；2：陰性對照；3：PCR產物A.Lrtm1基因PCR產物電泳鑒定B.pLJM1-GFP載體酶切電泳圖1：Marker；2：陽性對照；3：陰性對照；4~11：單克隆菌落C.陽性克隆PCR鑒定圖1重組質粒的構建4kb3kb2kb1kb1233kb2kb1kbAgeⅠEcoRⅠ--+++-+-3kb2kb1kb1234567891011—1293—
重慶醫(yī)科大學學報2018年第43卷第10期（JournalofChongqingMedicalUniversity2018.Vol.43No.10）圖3重組質粒pLJM1-Lrtm1-DDK在293T細胞中的表達P=0.000）。誘導分化上述2株穩(wěn)定細胞株0、96、120、144h后，收取細胞檢測Lrtm1mRNA表達水平（圖4C）。以GFP組為對照，對應時間點Lrtm1-DDK組的Lrtm1mRNA水平分別為GFP組的（72.3±10.76）×102、（79.23±12.33）×102、（127.41±8.75）×102、（140±12.1）×102倍。方差分析Lrtm1mRNA表達水平具有統(tǒng)計學意義（F=93.450，P=0.000）。Lrtm1-DDK組間兩兩比較，96h組較0h組增加（tD=9.792，P=0.000），120h組較96h組增加（tD=15.750，P=0.000），144h組較120h組增加（tD=17.300，P=0.000）。結果顯示：Lrtm1-DDK組隨誘導分化時間延長Lrtm1mRNA水平在0h過表達的水平上繼續(xù)升高。2.3.2qRT-PCR檢測Myogenin、MyosinmRNA水平表達誘導分化上述2株穩(wěn)定細胞株0、96、120、144h后，收取細胞檢測Myogenin、MyosinmRNA表達水平。結果如圖5A、B所示，檢測MyogeninmRNA表達水平，在144h時Lrtm1-DDK組（272.1±18.22）較GFP組（332.41±41.21）減少（P＜0.05），MyosinmRNA水平在分化144h時Lrtm1-DDK組（76.11±10.47）較GFP組（145.51±10.02）明顯減少（P＜0.05）。a：與0h組比較P=0.000；b：與48h組比較P=0.000；c：與72h組比較P=0.000A.qRT-PCR檢測MyosinmRNA水平表達h48h72h96h0a：與0h組比較P=0.000；b：與0h組比較P=0.000；c：與0h組比較P=0.000B.qRT-PCR檢測Lrtm1mRNA水平表達圖2誘導C2C12成肌細胞分化在檢測Lrtm1、MyosinmRNA水平表達0487296（h）acaba100101MyosinmRAN相對表達量0487296（h）110100Lrtm1mRAN相對表達量aabacLr
本文編號：2974436
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學學報. 2018,43(10)北大核心
【文章頁數】：7 頁
【部分圖文】：
kb1kb1234567891011B.pLJM1-GFP載體酶切電泳
s；55℃20s；60℃5s；40個循環(huán)。重復3次實驗，使用2-△△Ct計算相對mRNA含量，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內參基因GAPDH），△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組），2-△△Ct表示實驗組目的基因mRNA含量相對對照組改變的倍數。各基因引物序列見表1。1.2.3重組質粒的構建為進一步研究Lrtm1基因在成肌分化過程中的作用，本研究決定構建穩(wěn)定過表達Lrtm1的細胞株。將目的基因Lrtm1進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，電泳結果顯示，PCR擴增產物的長度為1164bp，與理論計算長度相同（圖1A）。pLJM1-GFP載體用AgeⅠ、EcoRⅠ內切酶（37℃，60min）酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示pLJM1載體雙酶切后出現的各個片段與理論計算的條帶相符（圖1B）。連接轉化后挑選8個單克隆菌落進行菌液PCR，實驗結果表明1~6號，8號克隆成功連接Lrtm1基因（圖1C）。表1各基因引物序列基因引物序列序列長度（bp）Lrtm1DDKMyogeninMyosinGAPDHF：5-TGTTGAATGAGGGTTTGTGCT-3R：5-TCCACGGAGTTTGATGATGG-3F：5-TGAGAAGATGGGAAGTAAGG-3R：5-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGT-3F：5-CTGACCCTACAGACGCCCAC-3R：5-TGTCCACGATGGACGTAAGG-3F：5-CCAAGGGCCTGAATGAGGAG-3R：5-GCAAAGGCTCCAGGTCTGAG-3F：5-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3R：5-AGTTGGGATAGGGCCTCTCTTG-31391421621531501：Marker；2：陰性對照；3：PCR產物A.Lrtm1基因PCR產物電泳鑒定B.pLJM1-GFP載體酶切電泳圖1：Marker；2：陽性對照；3：陰性對照；4~11：單克隆菌落C.陽性克隆PCR鑒定圖1重組質粒的構建4kb3kb2kb1kb1233kb2kb1kbAgeⅠEcoRⅠ--+++-+-3kb2kb1kb1234567891011—1293—
重慶醫(yī)科大學學報2018年第43卷第10期（JournalofChongqingMedicalUniversity2018.Vol.43No.10）圖3重組質粒pLJM1-Lrtm1-DDK在293T細胞中的表達P=0.000）。誘導分化上述2株穩(wěn)定細胞株0、96、120、144h后，收取細胞檢測Lrtm1mRNA表達水平（圖4C）。以GFP組為對照，對應時間點Lrtm1-DDK組的Lrtm1mRNA水平分別為GFP組的（72.3±10.76）×102、（79.23±12.33）×102、（127.41±8.75）×102、（140±12.1）×102倍。方差分析Lrtm1mRNA表達水平具有統(tǒng)計學意義（F=93.450，P=0.000）。Lrtm1-DDK組間兩兩比較，96h組較0h組增加（tD=9.792，P=0.000），120h組較96h組增加（tD=15.750，P=0.000），144h組較120h組增加（tD=17.300，P=0.000）。結果顯示：Lrtm1-DDK組隨誘導分化時間延長Lrtm1mRNA水平在0h過表達的水平上繼續(xù)升高。2.3.2qRT-PCR檢測Myogenin、MyosinmRNA水平表達誘導分化上述2株穩(wěn)定細胞株0、96、120、144h后，收取細胞檢測Myogenin、MyosinmRNA表達水平。結果如圖5A、B所示，檢測MyogeninmRNA表達水平，在144h時Lrtm1-DDK組（272.1±18.22）較GFP組（332.41±41.21）減少（P＜0.05），MyosinmRNA水平在分化144h時Lrtm1-DDK組（76.11±10.47）較GFP組（145.51±10.02）明顯減少（P＜0.05）。a：與0h組比較P=0.000；b：與48h組比較P=0.000；c：與72h組比較P=0.000A.qRT-PCR檢測MyosinmRNA水平表達h48h72h96h0a：與0h組比較P=0.000；b：與0h組比較P=0.000；c：與0h組比較P=0.000B.qRT-PCR檢測Lrtm1mRNA水平表達圖2誘導C2C12成肌細胞分化在檢測Lrtm1、MyosinmRNA水平表達0487296（h）acaba100101MyosinmRAN相對表達量0487296（h）110100Lrtm1mRAN相對表達量aabacLr
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