登革病毒(Dengue virus,DENV)是一種重要的蚊媒傳染病病毒。登革病毒主要通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊的叮咬在人群中擴(kuò)散,引起的臨床癥狀輕重不一,從溫和的登革熱(Dengue fever,DF)到嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革熱病例最常見。全球128個(gè)國(guó)家有25億人面臨登革病毒感染的風(fēng)險(xiǎn),每年感染者中大約有50萬(wàn)人需要住院治療,病死率在2.5%左右。熱帶和亞熱帶地區(qū)是登革病毒感染流行的主要區(qū)域,我國(guó)南部的廣東、海南和云南都屬于疫區(qū),幾乎每年都有登革病毒感染病例,其中2014年我國(guó)廣東省爆發(fā)登革熱疫情,感染病例達(dá)到46864人,其中6人死亡,造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題。目前針對(duì)登革病毒感染的防治藥物匱乏。賽諾菲-巴斯德公司研制的四價(jià)減毒活疫苗Dengvaxia從2015年底開始在墨西哥、菲律賓和巴西等三個(gè)國(guó)家獲得批準(zhǔn)使用,但是由于保護(hù)效果不理想且可能會(huì)對(duì)登革病毒血清抗體反應(yīng)為陰性的人群造成更嚴(yán)重的后果,2017年底菲律賓衛(wèi)生當(dāng)局已經(jīng)要求停止接種該疫苗。此外,目前市場(chǎng)上還沒有登革病毒感染的特效治療藥物,臨床上主要以對(duì)癥治療為主。因此,需要開發(fā)更有效的對(duì)抗登革病毒感染的防治手段。針對(duì)埃博拉、呼吸道合胞病毒感染的臨床實(shí)踐已經(jīng)證明中和抗體是一種有效的應(yīng)對(duì)病毒感染的治療方法,研究表明抗登革病毒的中和抗體也可以快速有效地中和小鼠體內(nèi)的登革病毒,達(dá)到抑制病毒增殖的目的,所以利用抗登革病毒中和抗體治療登革病毒感染,應(yīng)該是一種理想而有效的抗登革感染治療策略�；趩渭�(xì)胞PCR的抗體篩選制備方案是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種全人源的抗體制備技術(shù),其基本原理是采集患者或者疫苗免疫人群的外周血并分離單個(gè)B細(xì)胞,PCR擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的抗體基因,進(jìn)行表達(dá)和篩選。該技術(shù)可以快速獲得全人源抗體,而且所獲得的抗體經(jīng)過(guò)了體內(nèi)親和力成熟,具有非常大的優(yōu)勢(shì)。為了快速獲取抗登革病毒的抗體,本研究采用單B細(xì)胞抗體制備技術(shù),利用從恢復(fù)期登革熱患者外周血中分選得到的抗體分泌細(xì)胞擴(kuò)增抗體基因,開展了針對(duì)登革病毒的中和抗體的研制工作。本研究首先從3例恢復(fù)期登革熱患者采集了30mL外周血,利用密度梯度沉降法,分離淋巴細(xì)胞,然后根據(jù)B細(xì)胞表面分子標(biāo)記對(duì)分離獲得的淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞術(shù)分選CD19~(high)/CD20~(low to negative)/CD3~(negative)/CD27~(high)/CD38~(high)的單B細(xì)胞,共計(jì)1056個(gè)。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR和巢式PCR兩步從單B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因,最終獲得了496個(gè)H鏈,707個(gè)κ鏈,222個(gè)λ鏈可變區(qū)基因片段,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)輕重鏈配對(duì)的共有285對(duì),占初始細(xì)胞總數(shù)的27%左右,其中輕鏈為?的有223對(duì),輕鏈為λ的有62對(duì)。隨后將擴(kuò)增獲得的基因插入表達(dá)載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染FreeStyle~TMM HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá),成功表達(dá)261株抗體。以滅活的四種血清型的登革病毒等量混合作為抗原,通過(guò)ELISA篩選獲得88株可以特異結(jié)合滅活的登革病毒的抗體,陽(yáng)性率為33.7%。進(jìn)一步的體外中和活性評(píng)價(jià)顯示有24株抗體在濃度為10μg/m L時(shí)可以中和50%以上的DENV-1,其中1G5、3A6、6B1和9C7的中和活性最好,1G5和9C7的抑制率達(dá)到100%,3A6和6B1也都在95%以上。根據(jù)抗體對(duì)DENV-1體外中和活性評(píng)價(jià)的結(jié)果,我們選取中和活性最好的四株抗體進(jìn)行了親和力、交叉保護(hù)效果及體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)。以滅活病毒為抗原,利用ELISA評(píng)價(jià)抗體的親和力,結(jié)果顯示1G5對(duì)DENV-1的親和力較高,基本不與其他三種血清型病毒結(jié)合,3A6、6B1和9C7則均可結(jié)合四種血清型登革病毒,只是9C7對(duì)DENV-4的親和力較低,6B1對(duì)DENV-3和DENV-4的親和力較低。隨后我們利用蛋白免疫印跡初步分析四株抗體所識(shí)別的病毒抗原,結(jié)果顯示其中三株抗體(1G5、6B1和9C7)識(shí)別登革病毒的E蛋白,而3A6識(shí)別登革病毒的prM蛋白。另外,1G5和9C7均不結(jié)合原核表達(dá)的重組E蛋白,推測(cè)這兩株抗體識(shí)別的抗原表位可能是空間表位,也可能是具有糖基化等修飾的表位;6B1既可以識(shí)別病毒的E蛋白,又可以識(shí)別重組E蛋白,推斷6B1結(jié)合的位點(diǎn)可能是E蛋白上的線性表位。體外中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1G5針對(duì)DENV-1有非常好的保護(hù)效果,與其他三種血清型的病毒沒有交叉保護(hù)效果;9C7、3A6和6B1可以同時(shí)中和四種血清型的病毒,但是9C7的中和活性比3A6和6B1高10倍以上,因此我們選擇1G5和9C7進(jìn)行了體內(nèi)抗病毒活性評(píng)價(jià)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1G5可有效預(yù)防和治療致死劑量的DENV-1對(duì)乳鼠的攻擊。9C7可有效預(yù)防和治療致死劑量的四種血清型登革病毒對(duì)乳鼠的攻擊。登革病毒抗體引起的抗體依賴的感染增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancment,ADE)是限制其臨床應(yīng)用的重要因素,我們利用K562細(xì)胞作為感染模型檢測(cè)抗體依賴的感染增強(qiáng)效果,結(jié)果顯示:1G5和9C7在亞中和濃度時(shí),均可增強(qiáng)登革病毒的感染,產(chǎn)生ADE作用。為了降低這兩株候選抗體的ADE活性,我們分別在其Fc段引入突變,檢測(cè)結(jié)果顯示改構(gòu)后的抗體分子在亞中和濃度時(shí)對(duì)登革病毒的感染增強(qiáng)作用均顯著降低或消除。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素受體基因缺失(Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-))的免疫缺陷模型小鼠是登革病毒感染和評(píng)價(jià)抗體體內(nèi)抗病毒活性的首選模型動(dòng)物。我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-)的免疫缺陷模型小鼠,為抗登革病毒中和抗體研制工作的進(jìn)一步順利開展奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究建立了從單個(gè)B細(xì)胞制備抗體的方法,可以從感染患者或疫苗免疫人群的外周血中快速高效的制備中和抗體,研究篩選到2株具有良好的體內(nèi)外中和活性的抗登革病毒全人源單克隆抗體,抗體經(jīng)過(guò)改造后,已檢測(cè)不到明顯的ADE作用,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的評(píng)價(jià)和優(yōu)化,具有開發(fā)為治療登革病毒感染的被動(dòng)免疫制劑的潛力。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 DENV 基因組 RNA 所編碼的 10 個(gè)蛋白質(zhì)[8]DENV 的基因組是 11Kb 的單股正鏈 RNA，編碼 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（包膜蛋白 E、前體蛋白 prM 和衣殼蛋白 C）和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）[9]，如圖 1 所示。位于毒顆粒內(nèi)部的C蛋白富含賴氨酸和精氨酸，與基因組RNA結(jié)合而發(fā)揮保護(hù)作用。毒顆粒表面展示的是 prM 蛋白和 E 蛋白，這兩種糖蛋白均是 DENV 重要的保護(hù)

圖 2 DENV E 蛋白結(jié)構(gòu)及其在成熟病毒顆粒上的排列[18]注： A：成熟病毒顆粒表面 E 蛋白的結(jié)構(gòu)，6 個(gè) E蛋白排列形成 3 個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)，綠色標(biāo)的是融合肽；B：E 蛋白由胞外區(qū)、兩個(gè)親性螺旋和保守的莖區(qū)以及兩個(gè)跨膜螺旋組成，紅、黃、藍(lán)依次代表胞外區(qū)的結(jié)構(gòu)域 I、結(jié)構(gòu)域 II 和結(jié)構(gòu)域 III。在病毒的感染過(guò)程中，DENV 首先附著于宿主細(xì)胞膜表面，并通過(guò)受體介導(dǎo)

圖 3 DENV的生命周期[8, 18]V 病毒顆粒結(jié)合特定的受體并通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)宿主細(xì)胞膜在低 pH 的情況下融合，將病毒 RNA 釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中和翻譯，病毒顆粒在 ER 中進(jìn)行組裝，在 TGN 中進(jìn)行翻譯后修飾和加粒被胞吐釋放。在 DENV 生命周期的不同階段，病毒顆粒存在三種重）不成熟病毒顆粒，2）成熟病毒顆粒和 3）融合后構(gòu)象。B）prM 蛋白
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 林毅雄;魏泉德;張麗榮;沈韌;黃輝濤;周蘭蘭;;2012年-2014年珠海市流行的Ⅰ型登革病毒分子溯源分析[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2017年01期

2 謝仕蘭;陳守義;;登革病毒和蠕蟲感染與免疫[J];疾病監(jiān)測(cè);2017年01期

3 周旋;鐘麗梅;胡亮杉;林茂銳;曹東林;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法在登革病毒臨床檢測(cè)中的運(yùn)用[J];新醫(yī)學(xué);2017年11期

4 楊正時(shí);;原型(祖先)森林登革病毒與外溢感染[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2016年11期

5 李竹石;林華;楊健;楊會(huì)強(qiáng);曾獻(xiàn)武;趙宇;劉俐;劉莉娜;康莊;俞永新;李玉華;;登革病毒4型E蛋白的表達(dá)與多克隆抗體的制備[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2012年11期

6 李佳怡;左麗;孫汭;;登革病毒感染樹突狀細(xì)胞的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2010年05期

7 肖瑞;江振友;;登革病毒受體的研究進(jìn)展[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年01期

8 王云霞;黃慶;陳鳴;府偉靈;;登革病毒快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

9 徐華,車小燕;登革病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2005年06期

10 貢樹基;趙衛(wèi);曹虹;;登革病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2005年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陸健昇;抗登革病毒人源單克隆抗體研制[D];軍事科學(xué)院;2018年

2 曹政;登革病毒空殼疫苗研制及病毒空殼制備關(guān)鍵技術(shù)[D];重慶大學(xué);2014年

3 陳水平;登革病毒prM-E基因的多價(jià)重組質(zhì)粒DNA的免疫原性研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

4 肖維威;登革病毒檢測(cè)基因芯片的研制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 葛春喜;白紋伊蚊對(duì)登革病毒細(xì)胞內(nèi)免疫的研究[D];中山大學(xué);2002年

6 彭濤;Clathrin內(nèi)吞途徑在登革病毒進(jìn)入ECV304細(xì)胞過(guò)程中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

7 朱武洋;衣殼蛋白基因突變對(duì)登革病毒生物學(xué)性質(zhì)的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

8 張志珊;1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ區(qū)的表達(dá)及其在血清學(xué)診斷和免疫保護(hù)方面的應(yīng)用研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

9 尉雁;登革2型病毒基因組3’非編碼區(qū)對(duì)翻譯的調(diào)控作用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

10 趙慧;重要蚊媒黃病毒在IFN-α介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張春濤;抗登革病毒藥物體外篩選模型的建立及FNC抗登革病毒的活性研究[D];大理大學(xué);2018年

2 賈志榮;白紋伊蚊抗溴氰菊酯品系的建立及其對(duì)登革病毒易感性的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

3 楊笑涵;登革病毒血清抗體分型方法的建立與初步應(yīng)用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2017年

4 郭勇暉;登革病毒NS1蛋白及其抗體在重癥登革發(fā)病機(jī)制中作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

5 馬廣輝;基于蛋白酶為靶點(diǎn)的RNA病毒EV71/DENV新型抑制劑的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所);2017年

6 謝佩雯;基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標(biāo)[D];中南大學(xué);2013年

7 羅婭莎;分子診斷技術(shù)平臺(tái)的建立及其在呼吸道病毒與登革病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 晉晶;Ⅲ型登革病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備、鑒定及方法學(xué)建立[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

9 馬珍元;2014年深圳市1型登革病毒流行株的分子溯源及全基因組序列分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

10 馬秀芝;云南西南部地區(qū)健康人群登革病毒血清抗體調(diào)查及白紋伊蚊rDNA-ITS2序列初步分析[D];大理學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2871195