PD-1分子屬免疫球蛋白超家族成員,人PD-1分子為含有288個氨基酸的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表達于活化的T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞等。PD-1與其配體PD-L1、PD-L2相結合,發(fā)揮負性調(diào)控作用,參與維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。PD-1/PD-Ls免疫調(diào)節(jié)功能異常參與了自身免疫疾病和腫瘤等的重要病理機制。本文主要研制鼠抗人PD-1單克隆抗體,對其生物學功能進行鑒定,以期為PD-1/PD-Ls途徑的研究提供研究工具和實驗依據(jù)。第一部分構建人PD-1基因轉(zhuǎn)染細胞株目的:構建人PD-1基因轉(zhuǎn)染細胞株,以用于PD-1單克隆抗體的研制。方法:將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體p EGZ-term-R/PD-1以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細胞,收集具有感染能力的病毒上清,感染L929細胞,經(jīng)G418篩選后,采用流式細胞術和Western Blot方法鑒定該細胞株PD-1分子的表達。結果:獲得一株穩(wěn)定表達人PD-1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/PD-1。結論:成功構建穩(wěn)定表達人PD-1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株,為研制PD-1單克隆抗體提供免疫原。第二部分鼠抗人PD-1單克隆抗體制備及鑒定目的:研制PD-1單克隆抗體為探討PD-1/PD-Ls途徑建立研究工具。方法:采用穩(wěn)定表達人PD-1基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/PD-1,免疫BALB/c小鼠,采用常規(guī)B淋巴雜交瘤技術,經(jīng)HAT培養(yǎng)篩選、間接免疫熒光分析,獲得一株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株15D9;采用快速定性試紙法鑒定單克隆抗體類型;利用流式細胞術檢測競爭結合位點、抗體效價;采用細胞免疫化學實驗鑒定15D9對PD-1分子的識別。結果:獲得一株穩(wěn)定分泌抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株,命名為15D9;15D9重鏈為Ig G1,輕鏈為κ鏈;競爭結合實驗結果顯示單抗15D9與單抗6E1識別相似位點;抗體效價結果顯示,0.3μg/test可用于間標流式細胞術檢測,1μg/test可用于直標流式細胞術檢測;細胞免疫化學實驗結果顯示,15D9可特異性識別PD-1分子。結論:成功獲得一株穩(wěn)定分泌抗人PD-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株15D9,可用于免疫熒光標記、流式細胞術和免疫組化實驗。第三部分鼠抗人PD-1單克隆抗體的阻斷功能鑒定目的:通過觀察單抗15D9在PBMC活化過程中的作用,初步鑒定單抗15D9的生物學功能。方法:采用激發(fā)型CD3單克隆抗體包被,聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體活化PBMC,于24 h、48 h、72 h檢測PD-1和PD-L1分子的表達。加入單抗15D9后,觀察PBMC的形態(tài)變化,細胞計數(shù)法檢測PBMC數(shù)量變化。采用流式細胞術檢測CD69、CD25在24 h、48 h和72 h的表達水平。采用ELISA檢測在96 h時IL-2和IFN-γ的分泌量。結果:激發(fā)型CD3單克隆抗體聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體活化PBMC后,PBMC表達PD-1和PD-L1分子。加入單抗15D9后,CD3+CD28+15D9組與CD3+CD28+Ig G組相比,PBMC集落直徑增大、集落數(shù)量增多,PBMC的CD69、CD25表達增高,分泌的IFN-γ升高。結論:激發(fā)型CD3單克隆抗體聯(lián)合激發(fā)型CD28單克隆抗體可活化PBMC,加入單抗15D9后PBMC活化程度增強,表明15D9是一株具有阻斷功能的單克隆抗體。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 B7-CD28 家族共抑制信號(引自 Immunity, 2016, 44(5): 955-972)分子結構及表達譜 B7-DC 或 CD273，Tseng 和同事于 2002 年從 DC的基因文庫中鑒定了 B7-DC。小鼠 PD-L2（mPD-L 247 個氨基酸的前體蛋白，具有 23 個 氨基酸的 NmB7-DC 與人 B7-DC（hB7-DC）具有 70％的同源處在于它具有較長的胞質(zhì)尾巴。hPD-L2 基因位于 9，但細胞質(zhì)區(qū)較短。采用同源性檢索的方法，發(fā)現(xiàn)性（34％同一性，48％相似性）[21]。達譜較 PD-L1 窄，僅表達于 DCs 以及活化的巨噬細和培養(yǎng)的骨髓來源的肥大細胞[21-22]。在與 PD-1 結

圖 2 腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)途徑(引自 Nat Immunol. 2013, 14(10): 1014–1022)PD-L1、PD-L2 途徑與腫瘤免疫治療常涉及多種抵抗機制，可以逃逸宿主腫瘤免疫系統(tǒng)免疫卡控點抑制劑顯著增強抗腫瘤免疫性。免疫卡控cular）是免疫系統(tǒng)中的多種激活和抑制途徑，其對維理學免疫應答的持續(xù)時間和幅度至關重要。CTLA-4從而引發(fā)免疫應答，是第一個經(jīng)臨床驗證的免疫卡控的相互作用可以增強抗腫瘤反應，延緩腫瘤生長，并卡控點促進腫瘤細胞破壞是癌癥免疫治療的重要策和 Pembrolizumab 分別是人的和完全人源化的 IgG4 P斷 PD-1 并通過消除 PD-1 介導的 T 細胞抑制來促進

圖 2 Western Blot 鑒定 L929/PD-1 細胞 PD-1 的表達2：抗原為 L929 細胞裂解蛋白；3：抗原為 L929/M胞裂解蛋白討 論徑在機體免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。PD-1 與配遞負信號，其負性調(diào)節(jié)細胞因子分泌并促進 T染細胞株可應用于 PD-1 生物學功能研究，也開展 PD-1/PD-Ls 途徑的研究工作提供研究工具立了人 PD-1 基因轉(zhuǎn)染細胞株 L929/PD-1。首先-Term-R重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以及輔助病毒p轉(zhuǎn)染 293T 細胞。為了提高轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染過素，包括轉(zhuǎn)染細胞的生長狀態(tài)、DNA 復合物與
【參考文獻】

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1 駱群;呂明;于鳴;黎燕;;抗CD28抗體協(xié)同刺激增強抗CD3抗體體外激活T淋巴細胞并降低TGF-β的表達[J];中國實驗血液學雜志;2006年03期

本文編號：2858503