背景調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是一類具有顯著免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+T細(xì)胞亞群,通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能活性在膿毒癥免疫紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是在多種生理或病理?xiàng)l件下引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集,導(dǎo)致ER功能受損的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥可誘發(fā)機(jī)體發(fā)生ERS反應(yīng),通過(guò)調(diào)控多種免疫細(xì)胞功能,在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。盡管目前已經(jīng)明確Treg在膿毒癥免疫紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用,ERS是否影響Treg細(xì)胞的功能及機(jī)制,目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。目的采用ERS特異性誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)刺激正常及內(nèi)毒素(LPS)體外模擬膿毒癥刺激條件下的小鼠脾臟Treg細(xì)胞,旨在探討ERS對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制。方法1、免疫磁珠法分離正常BALB/C小鼠脾臟Treg細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)鑒定Treg細(xì)胞純度。依TG(0.1μmol/L)刺激的時(shí)間不同分為0、6、12、24h組,依TG刺激的濃度不同設(shè)為0、0.05、0.1、0.2μmol/L組,刺激12h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg Foxp3及CTLA-4表達(dá)的時(shí)間/劑量效應(yīng)關(guān)系,確定最佳實(shí)驗(yàn)濃度及時(shí)間。2、給予TG刺激后,分別采用共聚焦顯微鏡檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、蛋白印跡分析(Western blot)檢測(cè)PERK信號(hào)通路GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表達(dá)變化,評(píng)價(jià)TG誘導(dǎo)Treg ERS的狀態(tài),分別采用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、CFSE示蹤染料標(biāo)記法檢測(cè)Treg的Foxp3及CTLA-4表達(dá)、細(xì)胞因子分泌、Th1/Th2分化及對(duì)Teff的增殖抑制反應(yīng),評(píng)價(jià)Treg的功能狀態(tài),并結(jié)合PERK信號(hào)通路抑制劑(GSK2656157),分析阻斷PERK信號(hào)通路后,Treg的功能變化,探討ERS調(diào)節(jié)Treg功能的分子機(jī)制。3、給予LPS模擬體外膿毒癥刺激,應(yīng)用TG后,應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Treg細(xì)胞內(nèi)GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表達(dá)、Foxp3 CTLA-4的表達(dá)、細(xì)胞因子分泌、Th1/Th2分化及對(duì)Teff的增殖抑制反應(yīng)以及應(yīng)用GSK2656157對(duì)Treg功能活性的影響,分析體外膿毒癥狀態(tài)下,ERS對(duì)Treg功能狀態(tài)的影響和可能作用靶點(diǎn)。結(jié)果1、采用免疫磁珠分選得到Treg和Teff的純度分別為91%、88.2%,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求;檢測(cè)Foxp3及CTLA-4的表達(dá)的時(shí)效量效關(guān)系,結(jié)果表明,TG0.1μmol/L作用12h,Foxp3的表達(dá)變化最為顯著,故選擇TG0.1μmol/L、12h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),本研究顯示上述作用濃度及時(shí)間,Treg CTLA-4的表達(dá)均無(wú)明顯變化。2、給予TG刺激后,激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Treg內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生改變,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂、膨脹、并偏向核一側(cè)聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調(diào),同時(shí)Treg Foxp3表達(dá),IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加,與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降(P0.05),而給予阻斷劑GSK2656157后Treg Foxp3表達(dá),IL-10和TGF-β的分泌均明顯降低,與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性抑制情況減弱,共培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。3、LPS刺激Treg模擬體外膿毒癥狀態(tài)下,給予TG刺激后,GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調(diào),同時(shí)Treg Foxp3表達(dá),IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加(P0.05),與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降(P0.05),提示TG在LPS協(xié)同作用下進(jìn)一步增強(qiáng)Treg免疫抑制活性;而給予阻斷劑GSK2656157后檢測(cè)到GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著下降,Treg Foxp3表達(dá),IL-10和TGF-β的分泌均明顯降低(P0.05),與Treg共培養(yǎng),Teff的增殖活性抑制情況減弱,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。結(jié)論ERS是細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境刺激下的一種保護(hù)性機(jī)制,研究表明ERS對(duì)免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)具有重要調(diào)節(jié)效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示:1、給予ERS誘導(dǎo)劑TG刺激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生改變,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂、膨脹、并偏向核一側(cè)聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調(diào),提示TG誘導(dǎo)ERS反應(yīng)發(fā)生,Treg Foxp3表達(dá),IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加,Teff的增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降,提示TG誘導(dǎo)的ERS可明顯增強(qiáng)Treg的功能活性,而應(yīng)用PERK抑制劑后,Treg的功能活性顯著降低,提示PERK信號(hào)途徑是影響Treg功能的可能作用靶點(diǎn)。2、LPS刺激Treg模擬體外膿毒癥條件下,給予TG刺激,活化PERK信號(hào)通路誘導(dǎo)ERS反應(yīng)的同時(shí),進(jìn)一步增強(qiáng)Treg的功能活性,而給予PERK抑制劑后,通過(guò)阻斷PERK信號(hào)通路上分子的表達(dá),下調(diào)Treg功能。提示ERS可能通過(guò)PERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)Treg的免疫活性參與膿毒癥免疫紊亂的發(fā)生發(fā)展,而阻斷Treg PERK信號(hào)通路可能為膿毒癥免疫紊亂的治療提供潛在作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的 ERS 對(duì)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞免疫功能的將之前實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清從-20℃冰箱取出，室溫溶解，采用 ILF-β、IL-4、IFN-γ、IL-2 ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌情況（操作方法嚴(yán)格按照各 ELISA 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行），盡量減少人為誤差。.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以!未找到引用源。±s 表示，單因素多組數(shù)據(jù)方差分析對(duì)組間差異進(jìn)行比較結(jié)果之間比較采用成組 t 檢驗(yàn)，當(dāng) P<0.05 時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義2 結(jié)果.1 小鼠脾臟Treg分選純度及細(xì)胞活性檢測(cè)如圖 1.1 所示，小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次 MACS 分選后，得到 CD4的純度為 88.2%，Treg 純度為 91%，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性大于 95%。

與對(duì)照組相比較：*P<0.051.2 流式檢測(cè) TG 刺激對(duì) Treg Foxp3 及 CTLA-4 表達(dá)的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系 TG刺激對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化的影響如圖 1.3 所示：與正常對(duì)照組比較，TG 刺激可誘導(dǎo) Treg 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集、膨脹、碎裂，并偏向核一側(cè)聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生明顯適變化。提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可顯著誘導(dǎo) Treg 細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性改變。

組相比較：*P<0.05式檢測(cè) TG 刺激對(duì) Treg Foxp3 及 CTLA-4 表達(dá)的時(shí)間-劑量效激對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化的影響.3 所示：與正常對(duì)照組比較，TG 刺激可誘導(dǎo) Treg 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集、膨脹、碎裂，并偏向核一側(cè)聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可顯著誘導(dǎo) Treg 細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性改
【參考文獻(xiàn)】

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1 ;中國(guó)嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)[J];全科醫(yī)學(xué)臨床與教育;2015年04期

2 孫紅雙;呂菁君;魏捷;;血必凈注射液對(duì)膿毒癥患者凝血功能影響分析[J];臨床藥物治療雜志;2015年04期

3 王丹;夏炎火;周小潔;何杰;;大承氣湯聯(lián)合烏司他丁對(duì)膿毒癥合并多臟器功能衰竭綜合征患者降鈣素原、C反應(yīng)蛋白及免疫功能的影響[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2015年06期

4 余丹鳳;翁銀燕;徐建;胡馬洪;金東;張庚;;大承氣湯對(duì)行機(jī)械通氣嚴(yán)重膿毒癥患者炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能的影響[J];中國(guó)中醫(yī)藥科技;2011年03期

5 張寧;邱澤亮;葉一萍;徐俊龍;樓天正;雷后興;;參附注射液對(duì)嚴(yán)重膿毒癥患者炎癥細(xì)胞因子和預(yù)后的影響[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2011年03期

6 吳艷春;袁新旺;王靈聰;雷澍;智屹惠;江榮林;;解毒益氣活血方治療嚴(yán)重膿毒癥的療效觀察[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

7 吳祖煌;宋斌;陳國(guó)養(yǎng);;丹紅注射液對(duì)危重?zé)齻摱景Y患者血液流變學(xué)的影響及其臨床意義[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2010年31期

8 劉清泉;程發(fā)峰;孔令博;;血必凈注射液治療膿毒癥的系統(tǒng)綜述[J];中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育;2010年18期

9 蔣賢高;林曉;黃一統(tǒng);汪曉波;王仁數(shù);邵朝朝;施伎蟬;;三七總皂甙注射液對(duì)膿毒癥凝血功能的影響[J];中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2010年04期

10 曾韜;;川芎嗪對(duì)膿毒癥小鼠肺內(nèi)炎癥損傷的影響[J];荊楚理工學(xué)院學(xué)報(bào);2010年02期

本文編號(hào)：2852202