目的:研究Notch信號通路在骨形成蛋白9(Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9)誘導小鼠間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)C3H10T1/2成骨分化過程中的作用及機制。方法:1.NICD過表達質粒轉染間充質干細胞C3H10T1/2,實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測質粒NICD在細胞中的轉錄水平表達,Western Blot(WB)檢測NICD的蛋白表達水平。2.NICD及BMP9共同處理C3H10T1/2,通過檢測堿磷酶(ALP)活性、染色及茜素紅S染色明確NICD對BMP9誘導間充質干細胞成骨分化過程的作用,RT-qPCR檢測成骨分化過程中相關基因Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1、Id1、OSX 的轉錄水平表達,WB 檢測 Runx2、OPN、OCN、JunB、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8蛋白的表達水平。3 JunB基因的激動劑12-0-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)和Notch通路的抑制劑γ-分泌酶抑制劑(DAPT)分別與BMP9或NICD共同處理C3H10T1/2,ALP染色、活性及茜素紅S染色檢測成骨分化情況,WB再次檢測上述成骨分化相關蛋白的表達水平。4.另外,集落形成實驗檢測細胞自我更新能力及流式細胞儀檢測細胞周期變化,WB檢測NICD對增殖相關蛋白PCNA、Cyclin D1表達水平的影響。5.BMP9、NICD或TPA處理后的細胞注入裸鼠背側皮下異位成骨;MicroCT檢測異位成骨參數骨體積(BV/TV)、骨小梁厚度(BV/TV)、骨小梁間距(Tb/Sp)、骨小梁數量(Tb/Sp)、骨密度(BMD)的差異情況,免疫組化檢測成骨蛋白Runx2、OPN、OCN、JunB及成脂分化相關蛋白CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在異位骨中的表達情況,蘇木精-伊紅染色、三色染色、阿新藍染色檢測異位骨中骨組織、軟骨組織的生成情況,油紅O染色檢測異位骨中脂肪組織形成情況。結果:1.RT-qPCR及WB結果顯示過表達NICD質粒在C3H10T1/2細胞中高表達;2.NICD可抑制BMP9誘導的C3H10T1/2細胞成骨分化過程中成骨相關基因Runx2、OPN、OCN、OSX、JunB的表達及ALP形成和鈣鹽沉積,同時抑制成脂分化相關蛋白C/EBPα及PPARγ的表達,但不影響Smad1/5/8、p-Smad1/5/8的表達;3.基因JunB的激動劑TPA可逆轉NICD抑制BMP9誘導成骨分化的作用,促進成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表達;4.Notch通路抑制劑DAPT促進成骨分化相關基因p-Smad1/5/8、Runx2、OPN、OCN、JunB的表達,但抑制早期成骨指標ALP形成,促進晚期成骨指標鈣鹽沉積;6.集落成集實驗和流式細胞檢測顯示NICD明顯促進細胞增殖,NICD促進增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1的表達;7.異位成骨實驗結果顯示NICD明顯抑制BMP9誘導的骨形成,免疫組化結果顯示NICD抑制異位骨中成骨分化基因Runx2、OPN、OCN、JunB的表達,特殊染色HE、三色、阿新藍、油紅O染色顯示NICD抑制異位骨中骨組織、軟骨組織、脂肪組織的形成;8.TPA能逆轉NICD對BMP9誘導成骨的抑制作用,促進成骨相關基因的表達及骨組織的形成。結論:NICD激活的Notch通路參與調控BMP9誘導間充質干細胞C3H10T1/2成骨及成脂分化,通過下調基因JunB表達抑制BMP9誘導的成骨分化過程,但不影響B(tài)MP/Smad信號,且具有促進細胞增殖的作用。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

表達質粒激活Ｎｏｔｃｈ通路。ＮＩＣＤ質粒轉染Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞，４８ｈ后檢測ＮＩＣＤ表??達。ＲＴ－ｑＰＣＲ結果顯示，ＮＩＣＤ轉錄水平及Ｎｏｔｃｈ靶基因Ｈｅｙｌ、Ｈｅｓｌ較對照組明??顯增加（圖１Ａ）；?ＷＢ結果同樣顯示，與對照組相比，ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９的蛋白表達水??平明顯上升（圖１Ｂ）。??Ａ?Ｂ??６〇－｜?□?ＢＭＰ９＋Ｃｏｎｔｒｏｌ??ｃ?■?ＢＭＰ９＋ＮＩＣＤ?ＢＭＰ９??？２??｜４０－?Ｉ?ＮＩＣＤ?＿??｜?２〇－?Ｉ?§?ｐ－ａｃｔｉｎ?—???＂Ｊ－ｌ?ｎｉ?－ｉ?－ｆ?，?／?／?，??＃?ｚ＃?，ｘ°?ｙ??圖１．?ＮＩＣＤ、ＢＭＰ９在Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中高表達??Ｆｉｇ?ｌ．Ｔｈｅ?ｈｉｇｈ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ａｎｄ?ＢＭＰ９?ｉｎ?Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２?ｃｅＵｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｏｒ?ｔｈｅ??Ｎｏｔｃｈ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?Ｈｅｙｌ，?Ｈｅｓｌ，?Ｈｅｓ５?ｖｉａ?ＲＴ－ｑＰＣＲ．．（Ｂ）?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＮＩＣＤ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ??ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ．??２．２?ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９誘導的間充質干細胞成骨分化??為明確Ｎｏｔｃｈ信號通路在ＢＭＰ９誘導間充質干細胞成骨分化過程中的作用，??分別在ＮＣＥＤ或ＢＭＰ９處理細胞５ｄ、７ｄ后檢測早期成骨指標ＡＬＰ表達，結果顯??示

Ｂｌａｎｋ?ＮＩＣＤ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖５．?ＮＩＣＤ促進細跑增殖且維持間充質干細胞自我更新能力??Ｆｉｇ?５．?ＮＩＣＤ?ｉｓ?ｉｎｖｏｌｖｅｄ?ｉｎ?ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?ｃｅｌｌｓ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｗ??ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ??（Ａ）?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｃｙｃｌｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｇｅｎｅｓ?ＰＣＮＡ?ａｎｄ?ＣｙｃｌｉｎＤｌ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌｓ??

圖７．ＮＩＣＤ抑制ＢＭＰ９誘導的間充質干細胞成脂分化??Ｆｉｇ，７?ＮＩＣＤ?ｉｎｈｉｂｉｔｓ?ＢＭＰ９－ｉｎｄｕｃｅｄ?ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＭＳＣｓ??（Ａ）?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｃ／ＥＢＰａ?ａｎｄ?ＰＰＡＲｙ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ?ａｆｔｅｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ??ｗｉｔｈ?Ａｄ－ＢＭＰ９，?ｔｈｅ?ＮＩＣＤ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｆｏｒ?９?ｄａｙｓ．?（Ｂ）?Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ?ｓａｍｐｌｅｓ．?Ｆｒｏｚｅｎ??
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本文編號：2846729