目的:制備嵌合結腸癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒樣顆粒(VLP)。方法:通過重疊PCR將新抗原編碼序列插入截短型HBcAg(1～149 aa)第78、79位氨基酸編碼序列之間,并將融合基因克隆至原核表達載體pET-22b(+),轉化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達后,利用親和層析與超濾管純化濃縮目的蛋白,通過Western印跡、粒徑分析與透射電鏡成像鑒定嵌合病毒樣顆粒。結果:構建了pET-22b(+)重組表達載體并轉入大腸桿菌BL21(DE3),SDS-PAGE結果顯示在30℃經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導5 h即可獲得高濃度的可溶性蛋白,通過親和層析與超濾濃縮得到了純度良好的目的蛋白;Western印跡結果表明連有His標簽的目的蛋白獲得表達且濃度較高;透射電鏡成像可見密集的大小均一、空心的球形病毒樣顆粒結構。結論:制備出濃度與純度良好且組裝正確的嵌合HBcAg VLP。
【部分圖文】：

經(jīng)IPTG誘導后，Adpgk-HBcAg pET-22b(+)菌體裂解沉淀中相對分子質量15×103偏上位置處出現(xiàn)特征條帶；在Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）菌體裂解上清的同樣位置出現(xiàn)了特征條帶，而其沉淀中未出現(xiàn)該特征條帶，說明RD的引入增加了目的蛋白的水溶性。未誘導的菌體在該位置出現(xiàn)較淺的特征條帶，應為本底表達。見圖2。2.3 Western印跡檢測Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達

Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）重組表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3）感受態(tài)細胞，1mmol/L IPTG、30℃誘導5 h，菌體超聲波裂解、離心后，通過Ni+親和層析柱純化并超濾濃縮，取菌體裂解上清與蛋白濃縮樣品進行SDS-PAGE分析。圖4泳道1為未經(jīng)IPTG誘導的菌體裂解、離心后的上清檢測結果，條帶致密是因菌體內(nèi)雜蛋白所致，而在預估位置未出現(xiàn)明顯條帶，表明未經(jīng)IPTG誘導時目的蛋白表達量較低。泳道2為經(jīng)IPTG誘導后的結果，由于蛋白未經(jīng)純化，所以條帶依然非常致密，但在目的蛋白位置15×103偏上處可見一條明顯的粗條帶，表明IPTG誘導表達的即為目的蛋白Adpgk-RD-HBcAg，且誘導表達量較高。泳道3為誘導表達的目的蛋白經(jīng)Ni+柱純化與超濾后的結果，可見條帶致密現(xiàn)象有明顯改善，而且在預估位置有明顯條帶出現(xiàn)，說明蛋白誘導表達成功且純化效果較好。但在泳道3中也略微可見一些其他蛋白條帶，這是因為在天然菌體中也會有一些Ni+親和的蛋白。圖3 Western印跡檢測Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達

Western印跡檢測Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達
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