第一部分脂肪干細胞的分離、純化及培養(yǎng)目的:建立一種分離、純化及培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)簡便有效的方法,為組織工程學提供理想的種子細胞。方法:1、選健康成年SD雄性大鼠,大鼠腹部和腹股溝處剪取皮下脂肪,采用酶消化法分離出脂肪干細胞,通過體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代方法,純化、擴增脂肪干細胞。2、倒置相差顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)學變化,用免疫熒光法檢測表面抗原CD44表達情況。3、分離培養(yǎng)的脂肪干細胞行成軟骨、成骨誘導分化,特定試劑進行細胞染色,確定脂肪干細胞的分化潛能。結(jié)果:1、取材4h后可見細胞貼壁,散在分布,48 h后貼壁細胞有觸角伸出,體積增大,呈纖維細胞樣的短梭形,顆粒逐漸增多,五六天后細胞呈集落樣生長,細胞變?yōu)殚L梭形,旋渦狀排列,傳代后,細胞形態(tài)均一,克隆形成。2、熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光,DAPI復染核呈藍色,ADSCs細胞表面抗原CD44呈陽性表達。3、脂肪干細胞成軟骨誘導后分化形成質(zhì)地致密的細胞團,然后使用阿利新藍染色,鏡下觀察細胞內(nèi)呈現(xiàn)大量藍色基質(zhì)顆粒;成骨誘導后分化使用茜素紅染色可見大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論:酶消化法分離、貼壁純化傳代出的脂肪干細胞,生長狀態(tài)良好、增殖速度快、純度高,是一種簡便而有效的分選培養(yǎng)方法,可得到理想的種子細胞,為后續(xù)的實驗提供可靠的、穩(wěn)定的細胞來源。第二部分Wnt通路和Sox9相互反饋調(diào)節(jié)脂肪干細胞成軟骨分化中的作用目的:研究Wnt通路對脂肪干細胞成軟骨分化能力的影響,觀察Sox9在脂肪干細胞成軟骨誘導分化過程中的表達,重點研究兩者相互之間的關(guān)聯(lián),探討Wnt通路調(diào)控脂肪干細胞成軟骨分化的作用機制。如果能夠?qū)⑵鋺糜谂R床,相信能夠為骨關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)軟骨組織缺損后修復、再生,提供實驗依據(jù),對ADSCs在促進骨關(guān)節(jié)康復治療領(lǐng)域的進一步廣泛應用意義重大。方法:1、激動劑LiCL刺激干預脂肪干細胞后,CCK-8法觀察ADSCs增殖活性及Western blot檢測PCNA蛋白的表達情況。2、脂肪干細胞成軟骨誘導分化各時期,對軟骨指標Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin進行Western blot、RT-q PCR層面的檢測,用以評估其向軟骨分化的能力。3、激動劑LiCL、抑制劑Dkk-1刺激干預脂肪干細胞成軟骨誘導分化,重點檢測干預后第7天(早期)、第21天(晚期),軟骨指標Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin的蛋白及m RNA的表達情況。4、脂肪干細胞成軟骨誘導分化第21-35天(后期),RT-q PCR檢測成熟軟骨Collagen2a、Collagen10及早期成骨分化指標RUNX2的m RNA水平,Western blot檢測Sox9、β-catenin蛋白的表達情況。5、激動劑LiCL、抑制劑Dkk-1刺激干預脂肪干細胞成軟骨誘導分化第28天(后期),Western blot檢測Sox9、β-catenin蛋白水平及Collagen2a、RUNX2蛋白分化指標。6、采用慢病毒作為載體,將Sox9基因轉(zhuǎn)染進脂肪干細胞,使其得到穩(wěn)定表達,RT-q PCR檢測成軟骨誘導分化過程中特異性標志物Collagen2a、Aggrecan表達水平,定量測定分泌型糖胺多糖(glycosaminoglycanes GAG)的含量。同時,對Sox9、β-catenin進行Western blot蛋白層面的檢測,用以評估其向軟骨分化的能力。7、Sox9慢病毒載體陽性轉(zhuǎn)染脂肪干細胞成軟骨誘導分化第21天,免疫熒光檢測Collagen2a的表達,Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白β-catenin、GSK-3β、p-β-catenin蛋白的表達情況;結(jié)果:1、激動劑LiCL刺激脂肪干細胞后,ADSCs增殖能力增強,且PCNA蛋白呈現(xiàn)高表達。2、軟骨指標Sox9、Aggrecan、Collagen2a的逆轉(zhuǎn)錄基因及蛋白表達隨著時間延長呈現(xiàn)增多態(tài)勢;GAG的含量也呈現(xiàn)增多態(tài)勢,且在第14天增加顯著。而Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin蛋白則先減少后增加。3、成軟骨誘導分化第7天(早期)、第21天(晚期),LiCL促進Sox9、Aggrecan、Collagen2a、β-catenin蛋白表達,Dkk-1抑制各軟骨指標表達;4、成軟骨誘導分化第21-35天(后期),隨著時間的推移,Collagen2a表達逐漸減少;RUNX2、Collagen10的m RNA表達逐漸增多,β-catenin蛋白表達逐漸增多,Sox9蛋白表達則逐漸減少。LiCl促進β-catenin蛋白表達,同時下調(diào)Sox9、Collagen2a蛋白的表達,DKK-1組結(jié)果則相反。5、Sox9慢病毒載體陽性轉(zhuǎn)染脂肪干細胞后,設(shè)置為轉(zhuǎn)染組,其Collagen2a、Aggrecan m RNA水平明顯高表達,GAG的含量測定也明顯高表達;Western blot檢測,Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組顯著低表達。6、成軟骨誘導分化第21天(晚期),免疫熒光檢測顯示Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組Collagen2a明顯高表達;Western blot檢測GSK-3β、p-β-catenin蛋白水平增高。結(jié)論:1、LiCL能激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,在成軟骨誘導分化中促進脂肪干細胞快速增殖。2、LiCL能激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,在早期調(diào)控Sox9促進成軟骨誘導分化,快速增殖;晚期繼續(xù)調(diào)控Sox9促進成軟骨誘導分化,后期慢慢下調(diào)Sox9,減弱成熟軟骨表型表達,使軟骨變得肥大、早期成骨增生。Dkk-1刺激可抑制Wnt通路,起相反作用。3、Sox9過表達可反饋抑制β-catenin蛋白的表達,促使其降解,維持成軟骨誘導的分化。
【學位單位】：廣西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

（2）48 小時后，脂肪貼壁細胞牢固粘附，生長良好，顆粒明顯增多，細胞體積較前明顯增大，遮光性弱，局部呈現(xiàn)出克隆樣集落生長；（3）6 天后，貼壁細胞形態(tài)表現(xiàn)大致呈現(xiàn)一樣，細胞體變得狹長，呈梭行或漩渦狀排列�？梢姍E圓形的細胞核，偶見雙核出現(xiàn)；（圖 1）1-11-21-3

圖 1-1、4 小時后脂肪干細胞形態(tài)學觀察圖 1-2、48 小時候脂肪干細胞形態(tài)學觀察圖 1-3、6 天后脂肪干細胞形態(tài)學觀察二、SD 大鼠脂肪干細胞表面抗原 CD44 的免疫熒光檢測免疫熒光法檢測傳代的脂肪干細胞，結(jié)果顯示細胞表面抗原CD44 呈陽性表達。（圖 2）圖 1 脂肪干細胞的形態(tài)學觀察2-1 2-22-3

圖 3-1、脂肪干細胞成軟骨誘導分化后，阿利新藍染色圖 3-2、脂肪干細胞成骨誘導分化后，茜素紅染色討論脂肪組織主要成分是脂肪細胞，約占 50%-70%，還有脂肪干細胞、脂肪祖細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、造血干細胞、免疫細胞等[13-16]。 脂肪干細胞（ADSCs）是由中胚層發(fā)育而來的多向分化潛能干細胞。2001 年，Zuk 等最早從抽吸的脂肪組織中分離得到。Zuk 等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞接種后 4 h 可見細胞貼壁，圖 3 脂肪干細胞二系分化
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳尉;梁芳;宋小琴;胡平安;劉敏;;人脂肪干細胞的提取和鑒定[J];中國組織工程研究;2015年28期

2 趙健;代志軍;王曉巖;馬欣楠;呂松岑;;Wnt3a在人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及相關(guān)性研究[J];航空航天醫(yī)學雜志;2014年09期

3 唐芳;馬武開;姚血明;;Wnt/β-catenin信號通路與骨關(guān)節(jié)炎[J];風濕病與關(guān)節(jié)炎;2014年02期

4 林芳;金靜君;張韜;紀斌峰;陳泳;;持續(xù)Wnt信號通路激活促進胚胎干細胞源造血干細胞的增殖[J];中國組織工程研究;2014年06期

5 劉琴;王麗平;喻晶;陳芳;刁波;張宜;;組織塊貼壁法擴增兔脂肪干細胞[J];中國組織工程研究;2014年01期

6 金靜君;林芳;張韜;陳泳;陳金煙;王坤;韓俊永;薛士杰;;外源性Wnt3a持續(xù)作用對小鼠胚胎干細胞Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2013年04期

7 陳慧;陳永進;張旻;;脂肪干細胞應用于軟骨缺損修復的研究新進展[J];口腔醫(yī)學研究;2012年11期

8 黃丹奇;;運用中醫(yī)腎主骨的理論治療膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床研究[J];中國臨床醫(yī)生;2011年05期

9 馬麗;;骨關(guān)節(jié)炎的治療體會[J];實用醫(yī)院臨床雜志;2011年02期

10 劉媛;王永福;;骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)濟學[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2011年02期

本文編號：2837565