目的:本論文利用分子克隆的方法構建人源PD-1(hPD-1)的兩種片段pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160的重組質粒,測序正確后,轉化至原核表達系統(tǒng)BL21宿主菌,經(jīng)IPTG誘導表達重組蛋白。hPD-1重組蛋白復性后,將高純度的重組蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,制備hPD-1蛋白的單克隆抗體,為制備具有病理診斷價值的單克隆抗體奠定一定的基礎。方法:利用PCR擴增hPD-1胞外段基因,構建hPD-1重組質粒。將其轉化至大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導表達hPD-1蛋白后,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證,利用Ni-NTA柱親和層析純化包涵體表達的hPD-1蛋白,復性后由AKTA純化系統(tǒng)進行分子篩凝膠過濾純化。將純化后的hPD-1蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠。免疫小鼠三次及一次加強免疫后取血,利用ELISA法測定血清的滴度,將血清滴度達到106的小鼠血清進行免疫組化(IHC)評價,最后利用雜交瘤技術制備anti-hPD-1單克隆抗體,利用ELISA法和IHC法篩選出效價高、IHC染色強、無非特異性染色的雜交瘤細胞株。最后對本論文制備的抗體進行亞型鑒定和純化,利用SDS-PAGE檢測純化效果以及通過IHC和Western-blot評價anti-hPD-1單克隆抗體的性能。結果:1、成功構建pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160重組質粒,以終濃度0.5 mM IPTG于37℃誘導菌株6 h獲得大量表達的hPD-1蛋白;2、利用所制備的hPD-1蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,小鼠血清效價均達到106以上;IHC實驗結果表明:膜定位較為清晰,陽性區(qū)域均出現(xiàn)較強染色;3、成功制備分泌anti-hPD-1單克隆抗體的雜交瘤細胞,最終篩選出四株雜交瘤細胞11F5-C9、9C12-A3、9C12-C8、9C12-C9;其中9C12-C8細胞株產(chǎn)生的抗體亞型是重鏈為IgG2a,輕鏈為κ型。四株細胞產(chǎn)生的抗體應用于IHC上均具有清晰的膜定位,陽性區(qū)域強著色,背景干凈且非特異性染色少,同時也可應用于Western-blot檢測;結論:在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達hPD-132-160蛋白作為免疫原,成功制備特異性強、親和力高的anti-hPD-1單克隆抗體,在IHC實驗上可獲得清晰的膜染色,達到商業(yè)化要求。
【學位單位】：福州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

原攝取與呈遞功能，恢復促炎癥因子ＴＮＦ－ｃｃ和ＩＬ－６的產(chǎn)生，進而恢復免疫細胞的活??性［３（）］。以上這些實驗結果表明：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓ途徑能夠抑制ＤＣ細胞的抗原攝取和遞??呈功能，從而抑制免疫效應的產(chǎn)生。??１．２．２?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑介導Ｔ細胞抑芾ＩＪ??ＰＤ－１常以單體的形式表達于多種免疫細胞表面，在Ｔ淋巴細胞的表面也可檢測??到ＰＤ－１的高表達。當Ｔ細胞表面ＰＤ－１受體與其配體ＰＤ－Ｌ１或ＰＤ－Ｌ２結合后，可負??性調控Ｔ細胞，導致Ｔ細胞免疫衰竭［３１］。其作用機制是：當ＰＤ－１識別其配體ＰＤ－Ｌｓ??并與之結合，使得ＰＤ－１胞漿區(qū)的ＩＴＳＭ蛋白序列磷酸化，進而募集酪氨酸磷酸酶??ＳＨＰ－１和ＳＨＰ－２。酪氨酸磷酸酶能使下游的效應分子磷脂酰肌醇激酶３?（ＰＩ３Ｋ）發(fā)生??去磷酸化，導致蛋白激酶Ａｋｔ活化誘導失敗。Ａｋｔ的活化失敗會抑制轉錄因子ＮＦ－ｋＢ??的活化，抗凋亡蛋白Ｂｃｌ－２與促生長轉錄因子Ｃ－ｍｙｃ表達下調，ＩＬ－２分泌及葡萄糖代??謝減少，從而抑制Ｔ細胞分化、增殖和細胞因子分泌。此外，ＳＨＰ－２也可使ＴＣＲ信??號相關的ＺＡＰ７０、ＣＤ－３；；及ＰＬＣ－ｙ去磷酸化，抑制下游信號［３２？］。??ＰＤ－Ｌ１??

??Ｊ??圖１－１?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑介導Ｔ細胞抑制??進一步的研宄表明：ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑對ＣＤ８＋Ｔ細胞的抑制效果要明顯高于??ＣＤ４＋Ｔ細胞。由于ＣＤ４＋Ｔ細胞能夠自分泌產(chǎn)生ＩＬ－２，?ＩＬ－２可以與Ｔ細胞表面的受體??３??

圖１－３抗體結構圖??
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本文編號：2835534