基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)是一種通過伊蚊傳播的甲病毒,它在非洲、南亞、東南亞等地區(qū)周期性暴發(fā),感染率極高~([1])。CHIKV感染導致基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF),患者會出現包括高熱、關節(jié)疼痛、皮疹等臨床癥狀,嚴重者可導致死亡~([2])。CHIKV已在全球100多個國家和地區(qū)出現,造成全球范圍內每年大約100萬人感染~([3])。2017年,WHO發(fā)布了10種優(yōu)先研究的潛在傳染病,CHIKF榜上有名。目前,尚無針對此病毒的疫苗和藥物上市。由于研究CHIKV所需的實驗室生物安全等級高,缺乏經濟有效的動物模型,限制了針對此病毒的藥物和疫苗研發(fā)。本課題的設計思路是構建高滴度的CHIKV假病毒,并建立可視化的假病毒小鼠感染模型,繼而建立一套安全、全面、合理的體內外中和抗體檢測方法,從而可在BSL-2實驗室環(huán)境下,對疫苗有效性進行評價。本研究利用密碼子優(yōu)化后的CHIKV膜蛋白表達質粒pCMV3.1-CHIKV進行假病毒的構建,對影響假病毒滴度的因素進行優(yōu)化,確定了包裝條件:利用轉染試劑lipo3000,以膜蛋白表達質粒pCMV3.1-CHIKV與骨架質粒pSG3Δenv.cmv.Fluc 1:2的比例轉染293T細胞,48h后收取上清。最終制備的CHIKV假病毒滴度可達1.0×10~7TCID_(50)/mL。利用已構建的CHIKV假病毒在細胞水平建立中和活性檢測方法并進行標準化研究。對假病毒敏感細胞、細胞和病毒加入量、檢測時間等參數進行優(yōu)化,確定其實驗程序和參數為:將待測樣品與400 TCID_(50)的CHIKV假病毒于96孔板混合孵育1h后,加入50000/孔的293T細胞,48h后檢測發(fā)光值并計算中和抗體滴度。該方法為疫苗、單抗、小分子化合物等抗病毒制品的篩選和評價提供了平臺�；贑HIKV高滴度假病毒,首次建立了CHIKV假病毒可視化小鼠感染模型。以尾靜脈途徑(IV)感染4周齡的BALB/c小鼠,利用活體成像技術,動態(tài)觀察病毒在小鼠體內的分布和代謝,并確定了CHIKV假病毒感染BALB/c小鼠的AID_(50)為4.9×10~3TCID_(50)。該模型的建立,使得在BSL-2環(huán)境下對CHIKV疫苗進行體內有效性評價成為可能。此外,本研究成功構建了針對CHIKV的DNA疫苗,采用已建立的體外中和抗體檢測方法,對DNA疫苗免疫的豚鼠和小鼠血清進行了檢測,發(fā)現該疫苗可誘導豚鼠及小鼠產生高滴度中和抗體,抗體滴度(ID_(50))可達1:8000以上。利用已建立的小鼠模型,對免疫血清進行了小鼠體內被動保護效果評價,結果表明該抗血清對CHIKV假病毒感染小鼠具有保護作用,且保護效果與抗體滴度相關(R~2=0.66)。此外,本研究發(fā)現,提前給予小鼠GM-CSF刺激,并采用電穿孔技術輔助免疫,能使DNA疫苗誘導小鼠產生更高滴度的中和抗體(p0.0005),且抗體滴度與保護效果相關(R~2=0.73)。將被動免疫與主動免疫的保護效果進行比較后發(fā)現,兩者的保護效果無顯著性差異(p=0.37)。此結果肯定了中和抗體在抗CHIKV假病毒感染中發(fā)揮的主要作用�？傊�,本研究成功構建了高滴度CHIKV假病毒,并于國內外首次建立了可視化的CHIKV假病毒小鼠感染模型�；诖私⒘税踩院�、靈敏度高的體內外中和活性評價方法。此檢測平臺可在BSL-2實驗室操作,對于藥物、疫苗、單抗等抗病毒制品的有效性評價提供了理想的檢測方法。
【學位單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

中國食品藥品檢定研究院碩士畢業(yè)論文非結構蛋白 nsP1 是一種含有 535 個氨基酸殘基的棕櫚�；鞍�，具有甲基轉移酶和鳥苷�；D移酶的活性，參與病毒基因組 RNA 的合成[16]。nsP2 是一種 C-端具有蛋白水解結構域的多功能蛋白，表現出半胱氨酸蛋白酶活性[6, 17]。此外，nsP2 還具有三磷酸酶和解旋酶活性，參與 RNA 的加工[18]。nsP3 的功能不詳，可能具有部分復制酶功能[13, 19]。nsP4 是 RNA 依賴的 RNA 聚合酶[20]。根據遺傳譜系分析，CHIKV包括1個血清型，3個基因型：西非型（Western Africangenotype）、東-中-南非洲型（East-Central-Southern African genotype）、亞洲型（Asiangenotype）[21]。

圖 1.2 CHIKV 世界范圍內流行區(qū)域[38]1.5 實驗室檢測由于 CHIKV、登革病毒（Dengue virus）和寨卡病毒（Zika virus）具有相似的臨床感染癥狀，常用實驗室檢測技術將其區(qū)分開來[39]。針對 CHIKV，目前常用的實驗室診斷方法有分離病毒、檢測病毒 RNA、分子生物學及特異性抗體檢測等[40]。CHIKV 通過血漿、血清或全血分離，之后可在體內外進行培養(yǎng)鑒定。Vero 細胞、BHK 21 細胞和 RD 細胞等都可用于 CHIKV 的分離培養(yǎng)。另外，可將病毒通過顱內注射乳鼠，實現體內培養(yǎng)傳代。分離后的病毒可用血清學方法進行鑒定[40, 41]。CHIKV 的血清學檢測主要包括間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescenceassay，IFA）、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、血凝抑制試驗（Hemagglutionation inhibition，HI）和空斑減少中和試驗（Plaquereduction neutralization test，PRNT）等。ELISA 可檢測抗 CHIKV 特異性 IgM 和 IgG抗體，IgM抗體在病毒感染后4-7天即可檢測出來，IgG抗體提示病人進入恢復期[42]

中國食品藥品檢定研究院碩士畢業(yè)論文2 實驗材料和方法料體表達載體 pcDNA3.1(+)達載體 pcDNA3.1(+)由本實驗室保存，用于 CHIKV 膜蛋白的表 疫苗載體 pDRVISV1.0苗載體 pDRVISV1.0 由中國疾病預防控制中心（CDC）邵一鳴教HIKV DNA 疫苗。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳星;蘇瑤;董方玉;陳盼;李克雷;高帆;卞蓮蓮;孫世洋;胡亞林;毛群穎;梁爭論;;柯薩奇病毒A組6型報告基因假病毒可視化感染模型的建立[J];中國病毒病雜志;2018年06期

2 王亞婷;李文生;閆小飛;齊宗利;郭華;;人乳頭瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗的制備及免疫效果評價[J];現代檢驗醫(yī)學雜志;2018年03期

3 王旭娜;王奔;;假病毒技術在醫(yī)學中的應用研究進展[J];健康之路;2015年08期

4 劉華雷,Lijun Rong,魏建超,陳溥言;整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒[J];中國病毒學;2005年02期

5 肖性龍;余以剛;翟建新;李惠芳;吳暉;;含組氨酸純化標簽的假病毒表達載體的構建與應用[J];中國生物化學與分子生物學報;2011年07期

6 徐樹瑩;喬錄新;史宣玲;徐萌;魏飛力;袁霖;石英;陳德喜;;HIV-1假病毒包裝方法的探討[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2014年01期

7 侯志飛;蔣棟;趙學森;曾輝;;誘導表達人IFITM3的293細胞株的建立及其對H1N1型流感病毒侵染作用[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2018年02期

8 夏平安;黨占國;周斌;陳溥言;崔保安;邱璜;盧高峰;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白介導的E蛋白假型鼠白血病病毒的構建[J];病毒學報;2008年05期

9 王艷海;韓曉旭;;HIV-1假病毒的研究進展[J];內蒙古醫(yī)學雜志;2012年07期

10 王萍;張高紅;鄭永唐;;基于假病毒篩選抗病毒藥物的研究進展[J];國際藥學研究雜志;2015年03期

相關會議論文 前3條

1 劉華雷;王志亮;周斌;陳溥言;;禽流感病毒血凝素蛋白假病毒體系的建立及侵入細胞機理[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學術研討會論文集[C];2005年

2 周斌;黨占國;劉珂;陳溥言;;整合豬瘟病毒囊膜蛋白的假型鼠白血病病毒感染性的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第三屆豬病防控學術研討會論文集[C];2008年

3 劉華雷;王志亮;陳溥言;;血凝素蛋白裂解位點對H5亞型禽流感病毒侵入細胞的影響[A];全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2006年

相關博士學位論文 前5條

1 種輝輝;人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）假病毒檢測體系的建立與應用[D];吉林大學;2008年

2 鄭學星;埃博拉病毒核酸檢測與病毒樣顆粒疫苗研究[D];中國農業(yè)科學院;2015年

3 盧燕來;人γδT細胞對A型流感病毒血凝素蛋白及假病毒的免疫應答研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

4 李金林;湖北地區(qū)漢坦病毒基因特征研究及假病毒的構建[D];武漢大學;2012年

5 李月濤;RVFV病毒樣顆粒的構建及其免疫原性研究[D];石河子大學;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 吳佳靜;基于假病毒的基孔肯雅病毒（CHIKV）疫苗有效性評價方法研究[D];中國食品藥品檢定研究院;2018年

2 丁文婷;脊髓灰質炎Sabin株假病毒的構建及生物學特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

3 徐燕;麗沙假病毒模型的構建與優(yōu)化[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

4 李倩倩;埃博拉病毒等高致病性傳染病假病毒小鼠感染模型的建立及應用[D];中國食品藥品檢定研究院;2017年

5 劉桂秀;脊髓灰質炎假病毒的構建及其在中和抗體檢測方法中的應用研究[D];中國食品藥品檢定研究院;2017年

6 郝曉甜;柯薩奇病毒B組5型野生型及假病毒小鼠模型的建立和初步應用[D];中國食品藥品檢定研究院;2017年

7 王洪;阿片類物質使用與HIV-1原發(fā)性耐藥的橫斷面研究及表型耐藥檢測假病毒的構建[D];廣西醫(yī)科大學;2016年

8 馬紅霞;HIV-1中和抗體快速安全的評價體系的研究[D];吉林大學;2006年

9 王京京;冠狀病毒假病毒系統(tǒng)的構建及其在受體識別中的應用[D];華中農業(yè)大學;2016年

10 王文波;誘導HIV-1中和抗體的膜蛋白抗原的優(yōu)化和改造[D];中國藥品生物制品檢定所;2011年

本文編號：2834166