第一部分蛋氨酸亞砜還原酶A在小膠質(zhì)細胞炎性激活中的作用 目的：蛋氨酸亞砜還原酶A(Methionine sulfoxide reductase A, MsrA)是蛋氨酸亞砜還原酶家族的重要成員之一,近年來由于其在體內(nèi)氧化還原過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。MsrA表達于高等動物的多數(shù)組織中,在心臟、肝臟等組織中表達尤為豐富。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,MsrA在包括海馬、皮層、中腦等在內(nèi)的多個腦區(qū)中均有分布。MsrA可以修復發(fā)生氧化損傷的蛋白,減緩氧化應(yīng)激,對包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細胞具有神經(jīng)保護作用。迄今為止,關(guān)于MsrA在小膠質(zhì)細胞中的表達及其功能鮮有文獻報道。鑒于氧化應(yīng)激在小膠質(zhì)細胞過度激活及神經(jīng)炎癥中的重要作用,本部分實驗旨在研究小膠質(zhì)細胞中是否存在MsrA表達,以及MsrA是否對脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)具有調(diào)控作用。 方法：通過RT-PCR技術(shù)在mRNA水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞中是否存在MsrAmRNA表達；通過Western blotting方法在蛋白質(zhì)水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞中是否存在MsrA蛋白表達；通過對原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞和大鼠腦片進行免疫熒光標記,在形態(tài)學水平確定小膠質(zhì)細胞中是否存在MsrA的表達以及MsrA的分布情況；利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)研究MsrA沉默對于LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)的影響；通過轉(zhuǎn)導基因重組Tat-大鼠源性MsrA融合蛋白(Tat-rMsrA fusion protein, Tat-rMsrA)外源性補充小膠質(zhì)細胞中的MsrA,研究MsrA上調(diào)對于LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)的影響；利用大鼠急性神經(jīng)炎癥模型,在動物水平研究Tat-rMsrA轉(zhuǎn)導對于小膠質(zhì)細胞激活以及神經(jīng)炎癥的影響。 結(jié)果：(1)從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別證實原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞中存在MsrA的表達,免疫熒光證實MsrA在小膠質(zhì)細胞的胞漿和胞核中均有分布；(2)LPS可誘導小膠質(zhì)細胞中的MsrA表達上調(diào)；(3)慢病毒沉默小膠質(zhì)細胞中的MsrA可加劇LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)；(4)向小膠質(zhì)細胞中轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)；(5)在大鼠急性神經(jīng)炎癥模型中,向海馬齒狀回區(qū)域注射Tat-rMsrA可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活以及致炎因子的產(chǎn)生。 結(jié)論：小膠質(zhì)細胞中存在MsrA的功能性表達,且MsrA可負性調(diào)控LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)。 第二部分蛋氨酸亞砜還原酶A負性調(diào)控小膠質(zhì)細胞炎性激活的機制 目的：小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應(yīng)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)密切相關(guān)。ROS可以作為“信號分子”激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)以及核因子-κB (nuclear-factor kappa B, NF-κB)等在小膠質(zhì)細胞介導的免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號級聯(lián)反應(yīng),從而加劇小膠質(zhì)細胞的異常活化以及炎癥反應(yīng)。因此,內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)可能是炎癥反應(yīng)加劇時重要的“剎車”機制。已有研究報道蛋氨酸氧化-還原循環(huán)在清除ROS以及保護蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點免受ROS攻擊的過程中扮演重要角色,而MsrA是調(diào)控蛋氨酸抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,因此,本部分實驗旨在研究小膠質(zhì)細胞中的MsrA能否通過催化ROS和蛋氨酸(methionine, Met)反應(yīng)清除LPS誘導的ROS生成,并進而抑制MAPKs以及NF-κB等信號通路,從而減緩LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)。 方法：通過western blotting方法檢測轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導的p38、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)以及核因子-κ.B抑制因子α (inhibitor of kappa B a, IκBα)磷酸化的影響；通過細胞免疫熒光技術(shù)研究轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導的NF-κB的p65亞基入核的影響；通過胞內(nèi)自由基檢測以及胞外超氧化物測定等方法研究轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導的ROS生成的影響；并通過電子自旋共振(electron spin resonance, ESR)、魯米諾化學發(fā)光檢測以及蛋氨酸亞砜檢測等技術(shù)研究Tat-rMsrA清除ROS的作用機制。 結(jié)果：(1)向小膠質(zhì)細胞中轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞中p38、ERK等MAPKs信號通路的激活；(2)向小膠質(zhì)細胞中轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞中NF-κB信號通路的激活；(3)向小膠質(zhì)細胞中轉(zhuǎn)導基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可減緩小膠質(zhì)細胞激活所引起的氧化應(yīng)激；(4) MsrA可通過催化L-蛋氨酸或蛋白質(zhì)中的蛋氨酸殘基和ROS反應(yīng)生成蛋氨酸亞砜(methionine sulfoxide, MetO),從而發(fā)揮自由基清除作用。 結(jié)論：MsrA可通過催化蛋氨酸和ROS反應(yīng),減少LPS誘導的ROS生成,并進一步抑制p38、ERK以及NF-κB等信號級聯(lián)反應(yīng)的激活,從而減緩LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其介導的炎癥反應(yīng)。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R36
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 蛋氨酸亞砜還原酶A在小膠質(zhì)細胞炎性激活中的作用
    一、材料與方法
    二、結(jié)果
    三、討論
    小結(jié)
第二部分 蛋氨酸亞砜還原酶A負性調(diào)控小膠質(zhì)細胞炎性激活的機制
    一、材料與方法
    二、結(jié)果
    三、討論
    小結(jié)
全文總結(jié)
本文創(chuàng)新點
展望
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀博士學位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝

【共引文獻】

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