肝臟在饑餓狀態(tài)下的能量平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。饑餓早期，肝臟糖原迅速分解，維持正常的血糖濃度，同時(shí)，肝臟的糖異生也開始啟動(dòng)，一些非糖物質(zhì)經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化后生成葡萄糖，入血后維持血糖濃度和提供能量。隨著饑餓時(shí)間的延長，脂肪組織分解，提供甘油和脂肪酸。甘油可以作為糖異生的原料，而脂肪酸能被進(jìn)一步氧化，為全身能量供應(yīng)提供支持。肝臟在進(jìn)行脂肪酸氧化過程中生成酮體，酮體入血后運(yùn)送到全身多個(gè)組織器官為細(xì)胞提供能量。因此，肝臟在饑餓的能量平衡中發(fā)揮了核心作用，而這些能量平衡調(diào)控的深層次機(jī)制涉及到多種錯(cuò)綜復(fù)雜的分子信號(hào)。換句話說，饑餓狀態(tài)下，糖原分解、糖異生、脂肪酸氧化、酮體生成等供能效應(yīng)，其本質(zhì)是細(xì)胞分子信號(hào)通路在饑餓環(huán)境下的適應(yīng)性調(diào)控過程。許多病理?xiàng)l件下，如糖尿病、脂肪肝等疾病，肝臟能量平衡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙，異常的分子調(diào)控導(dǎo)致了疾病的發(fā)生、發(fā)展。為此，深入研究肝臟代謝分子機(jī)制，可以豐富分子代謝理論，同時(shí)，為疾病的診治提供新的思路。 為適應(yīng)環(huán)境變化，信號(hào)分子在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等水平的多重調(diào)節(jié)下發(fā)生自身表達(dá)和活性的改變，以便適應(yīng)環(huán)境變化。饑餓時(shí)，肝臟中NAD依賴的蛋白去乙�；窼irt1通過翻譯后修飾（去乙�；┐龠M(jìn)PGC1α、FOXO1等代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的活性，而活化的轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制增加下游代謝相關(guān)酶的表達(dá)，促進(jìn)長期饑餓下肝臟的糖異生和脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)血糖的平衡和能量供應(yīng)�？梢�，饑餓環(huán)境下，肝臟細(xì)胞中的代謝相關(guān)信號(hào)分子受到了不同層面的多重調(diào)控。 RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在肝臟代謝中少有研究。STAR家族成員QKI（Quaking）是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，由qkI基因編碼，可產(chǎn)生多個(gè)異構(gòu)體，在全身多種組織細(xì)胞中表達(dá)。其中，QKI5主要定位于胞核，但也能穿梭到胞漿，而QKI6和QKI7主要分布在胞漿中。通過與mRNA的3UTR的特異性識(shí)別元件（QRE）結(jié)合，QKI在調(diào)節(jié)mRNA的胞漿/胞核定位、穩(wěn)定性、翻譯效率等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在神經(jīng)系統(tǒng)，QKI能增加MBP的表達(dá)，從而增加髓鞘的形成。在結(jié)腸癌中，QKI通過影響β-catenin的亞細(xì)胞定位，發(fā)揮抑癌基因效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，QKI同樣在肝臟表達(dá)，而有關(guān)其在肝臟中的功能尚沒有研究報(bào)道。 【目的】 （1）在體內(nèi)和體外模型中，查看QKI在肝臟饑餓能量平衡過程中的表達(dá)變化，分析QKI與糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成的相關(guān)性； （2）在體內(nèi)和體外模型中，探討QKI是否受乙�；揎椪{(diào)節(jié)，并闡明QKI的乙�；揎椩陴囸I肝臟能量代謝中的作用； （3）分析QKI乙�；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)分子機(jī)制，探討上游調(diào)節(jié)分子如何影響QKI，并在饑餓肝臟代謝中發(fā)揮效應(yīng)； （4）分析受乙酰化修飾調(diào)節(jié)的QKI通過調(diào)節(jié)哪些下游關(guān)鍵分子，從而影響肝臟饑餓能量代謝，并進(jìn)一步闡明QKI調(diào)節(jié)下游分子的深層次機(jī)制。 【方法和結(jié)果】 （1）在小鼠饑餓的肝臟組織、低糖和Forskolin/dexamethasone處理的HepG2細(xì)胞中，利用免疫組化、qRT-PCR和Western-blot檢測QKI的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟中，QKI5是主要表達(dá)的異構(gòu)體。與對(duì)照相比，QKI5的表達(dá)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。 （2）在上述饑餓模型中，使用乙酰化抗體進(jìn)行免疫共沉淀（IP），Western-blot檢測QKI5乙�；�；利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測QKI5可能的乙�；揎椢稽c(diǎn)；構(gòu)建乙�；稽c(diǎn)突變的QKI5表達(dá)載體，探討乙�；揎椀母淖儗�(duì)饑餓肝臟能量代謝的影響。結(jié)果表明，QKI5在饑餓的肝臟中表現(xiàn)為去乙�；癄顟B(tài)，而使用突變載體干預(yù)發(fā)現(xiàn)，QKI5的KH domain區(qū)賴氨酸突變?yōu)榫彼幔∕TR5，乙�；稽c(diǎn)缺失）時(shí)，促進(jìn)肝臟糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成；突變?yōu)楣劝滨０罚∕TQ5，相當(dāng)于乙�；陌被幔�，則抑制糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成。 （3）使用去乙�；窼irt1的抑制劑和激活劑，IP試驗(yàn)檢測肝臟細(xì)胞QKI5的乙�；剑辉诩�(xì)胞中干涉Sirt1的表達(dá)，檢測QKI5的乙�；�；在Sirt1敲除的小鼠肝臟中查看QKI5的乙�；�。結(jié)果表明，在肝細(xì)胞中抑制Sirt1的活性，QKI5乙�；皆黾�，促進(jìn)Sirt1活化，則導(dǎo)致QKI5去乙�；�；在干涉Sirt1表達(dá)的肝細(xì)胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝臟組織中，QKI的乙酰化水平都是升高的。 （4）在肝臟細(xì)胞中干涉QKI5、過表達(dá)QKI5、MTR5、MTQ5，結(jié)合饑餓模型刺激，qRT-PCR檢測肝臟代謝相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉QKI5或過表達(dá)MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表達(dá)，而過表達(dá)QKI5或MTR5則促進(jìn)FOXO1和PPARα表達(dá)。通過RNA-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QKI5與FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。 （5）通過報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證QKI5、MTR5和MTQ5對(duì)FOXO1和PPARα的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，過表達(dá)QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα報(bào)告基因的螢光素酶活性，而過表達(dá)MTQ5則抑制其活性。 【結(jié)論】 RNA結(jié)合蛋白QKI在饑餓肝臟能量代謝中發(fā)揮了重要作用。饑餓時(shí)，肝臟Sirt1促進(jìn)了QKI的去乙�；�，去乙酰化的QKI通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和PPARα的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)糖異生、脂肪酸氧化及酮體生成，從而在肝臟能量平衡中發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R333.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2825322