近年來(lái),由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的愈演愈烈的禽流感疫情給中國(guó)及其它國(guó)家養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失,并嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。H9N2是AIV一種亞型,不僅在全世界范圍的禽類(lèi)中廣泛流行,而且可以感染人,同時(shí)還是97年香港禽流感感染人事件的H5N1 AIV內(nèi)部基因的供體。在H9N2預(yù)防與免疫相關(guān)研究中,針對(duì)病毒的單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)因其具有分子量小、穿透力強(qiáng)及與抗原結(jié)合力強(qiáng)而備受青睞。本研究從NCBI基因庫(kù)中獲得針對(duì)H9N2 AIV的PB2蛋白的scFv序列,擬利用具有天然表達(dá)優(yōu)勢(shì)的大腸桿菌體廉價(jià)制備H9N2 AIV的單鏈抗體。由于scFv自身結(jié)構(gòu)特殊,其在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物基本以包涵體形式存在,經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性過(guò)程后,蛋白活性極低。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)基因工程方法,結(jié)合表達(dá)條件優(yōu)化和過(guò)程優(yōu)化,促進(jìn)H9N2AIVscFv在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),并初步檢測(cè)其與抗原PB2的結(jié)合能力。該實(shí)驗(yàn)首先合成針對(duì)H9N2 AIV scFv基因序列的引物,通過(guò)利用套疊PCR的方式獲得H9N2 AIV scFv基因片段序列,構(gòu)建至pET23a-T、pET23a-sfGFP-MAN載體中,獲得重組質(zhì)粒pET23a-scFv、pET23a-sfGFP-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta Blue菌株中,誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H9N2AIVscFv基因序列與超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)融合表達(dá)后,scFv可以獲得部分可溶性表達(dá),而未融合sfGFP的scFv即使經(jīng)過(guò)改變溫度、誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)周期,也未見(jiàn)可溶性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)套疊PCR的方式合成了 H9N2 AIV的PB2蛋白基因,并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA-DsRed載體上,獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-PB2-DsRed,通過(guò)Lipfectin3000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至HEK293T細(xì)胞表達(dá)PB2蛋白。將大腸桿菌中表達(dá)的scFv提取并純化,與pcDNA-PB2-DsRed轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),通過(guò)大腸桿菌獲得的針對(duì)H9N2的可溶性scFv能與表達(dá)的PB2蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別,初步顯示我們利用大腸桿菌獲得的針對(duì)H9N2 AIV可溶性scFv具有生物活性,為進(jìn)一步以該單鏈抗體建立緊急免疫接種和檢測(cè)診斷方法奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R392
【部分圖文】：

感病毒Ｈ９Ｎ２亞型作為新型禽流感病毒的基因供體逡逑實(shí)，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型可與多種亞型重配，包括高致病性的Ｈ圖１．邋２所示［５９］。類(lèi)Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是導(dǎo)致１９９７年Ｈ５Ｎ１亞型病毒的６個(gè)內(nèi)部基因供體；同樣也為２０１３年在中國(guó)Ｎ８病毒亞型提供了邋６個(gè)內(nèi)部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型配，導(dǎo)致了多種基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型。逡逑Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｎｈｕｉ／ＳＣ７０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑８０邋－邋Ａ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑Ａ／ｅｒＭｒｏｎｍｅｎｔ／２ｈｅｊｉａｎｇ／ｌ８／２０１３＜ＨＳ邋Ｎ２）逡逑｜邋Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈ６ｊｉａｎｇ／ＳＤ０３３／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑，Ａ／Ａｎｈｕｉ／１－ＤＥＷＨ７３０／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑１邋00邋－邋Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｎａｎ／Ｓ４１１１／２０１１邋（Ｈ９Ｎ２）逡逑｜—￣邐——Ａｙｊｔａｎｇｘｉ－Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）逡逑ＬＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅ｜ｊａｎｇ／３２ｇ／２0ｌｌ（Ｈ９Ｎ２｝逡逑邐——

１ｆｅＬ逡逑Ｓ邐ｈａ２X4逡逑圖１．邋１邋Ｈ９Ｎ２禽流感病毒抗原性相關(guān)的氨基酸三維圖逡逑禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型作為新型禽流感病毒的基因供體逡逑宄證實(shí)，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型可與多種亞型重配，包括高致病性的Ｈ６Ｎ１，邋Ｈ６Ｎ１，如圖１．邋２所示［５９］。類(lèi)Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是導(dǎo)致１９９７年香港爆發(fā)流感Ｈ５Ｎ１亞型病毒的６個(gè)內(nèi)部基因供體；同樣也為２０１３年在中國(guó)大陸出現(xiàn)Ｈ１０Ｎ８病毒亞型提供了邋６個(gè)內(nèi)部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型多次與Ｈ９Ｎ生重配，導(dǎo)致了多種基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型。逡逑

單鏈抗體是一種富含二硫鍵的蛋白質(zhì)，其功能活性依賴(lài)于二硫鍵的正確形成。二于單鏈抗體形成具有正常免疫功能的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象是必需的。一般情況而言，菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以硫氧還蛋白通路為主，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的單鏈抗體中硫醇基處于還原無(wú)法形成二硫鍵，從而很難獲得具有生物活性的單鏈抗體。大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中環(huán)境可促使硫醇基氧化，形成正確的二硫鍵，一般的方法誘導(dǎo)表達(dá)的量及其有限。逡逑有研究報(bào)道利用大腸桿菌獲得禽流感單鏈抗體，但由于單鏈抗體的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)桿菌的表達(dá)蛋白的特征，大腸桿菌表達(dá)的禽流感單鏈抗體在胞內(nèi)形成致密的包涵逡逑只有經(jīng)過(guò)裂解細(xì)胞，將包涵體溶解在變性劑中，通過(guò)復(fù)性得才能得到可溶性禽流抗體蛋白，實(shí)驗(yàn)流程如圖２．１所示。但這種方法主要的缺陷是：復(fù)性時(shí)需要經(jīng)過(guò)的稀釋去掉變性劑，然后進(jìn)一步濃縮，過(guò)程繁瑣，復(fù)性得率低（＜１５％）；另外，逡逑繁瑣的復(fù)性步驟獲得的禽流感可溶性單鏈抗體蛋白正確的空間構(gòu)象不一定１００％進(jìn)而影響其正常的生物活性，包括免疫活性。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2815540