吸煙對人體健康的危害已眾所周知。據(jù)統(tǒng)計,每年因為吸煙造成的死亡人數(shù)可達(dá)250萬人之多,吸煙已成為人們所公認(rèn)的危害人體健康極其重要的因素。相關(guān)研究表明,吸煙會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的堵塞,使巨噬細(xì)胞吞噬及遷移的能力降低,從而降低機(jī)體抗感染的能力。巨噬細(xì)胞作為人體的免疫細(xì)胞,參與人體多種疾病的發(fā)病過程,因此近年來巨噬細(xì)胞也被作為疾病治療的主要靶標(biāo),研究者們試圖通過對其功能的調(diào)控,使病情得到改善。細(xì)胞膜受體蛋白Integrins通過與胞內(nèi)骨架蛋白的相互作用來介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏著,參與了細(xì)胞的遷移及吞噬過程。因此本課題旨在通過研究尼古丁對巨噬細(xì)胞的功能、整合蛋白Integrins及細(xì)胞外間充質(zhì)蛋白FNs家族蛋白在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)的影響,試圖闡明影響巨噬細(xì)胞功能的相關(guān)分子機(jī)制,為巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供一個細(xì)胞活體水平的重要資料。本課題以原代巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264兩種細(xì)胞培養(yǎng)模型為研究對象,利用尼古丁對細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù),通過高內(nèi)涵活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)在活細(xì)胞水平上檢測尼古丁對巨噬細(xì)胞形態(tài)及功能方面的影響;采用免疫熒光染色、掃描電鏡對Integrins蛋白及FNs蛋白進(jìn)行定位分析;利用廣譜試劑盒檢測多種整合素蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)結(jié)合;Elisa方法檢測分析在RAW264細(xì)胞中不同的Integrins與FN-α蛋白間的相互作用;通過Western Blot技術(shù)從蛋白水平檢測尼古丁對Integrins蛋白和FNs蛋白在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的影響;利用實時熒光定量PCR方法從mRNA水平檢測Integrins蛋白在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示如下:(1)高內(nèi)涵分析結(jié)果顯示:在常規(guī)培養(yǎng)皿上,尼古丁使原代巨噬細(xì)胞的運(yùn)動速度及距離降低,長度和面積減小,運(yùn)動角度發(fā)生變化;在ECM基質(zhì)環(huán)境中,原代巨噬細(xì)胞的面積及長度在尼古丁處理后增大,運(yùn)動的距離減小,細(xì)胞運(yùn)動的速度在不同的作用時間存在一定的差異;小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264細(xì)胞的面積、長度、運(yùn)動速度及距離均在尼古丁作用不同時間之間存在顯著差異。原代巨噬細(xì)胞和RAW264細(xì)胞的運(yùn)動轉(zhuǎn)角在ECM培養(yǎng)環(huán)境中均無顯著性差異。(2)免疫熒光及掃描電鏡結(jié)果顯示:Integrins蛋白呈點(diǎn)狀分布在巨噬細(xì)胞的偽足,FN-α蛋白也呈點(diǎn)狀分布在細(xì)胞的遷移軌跡及細(xì)胞的偽足上。該兩種蛋白具有一定的共定位現(xiàn)象,在尼古丁作用后,Integrinβ1、Integrinαv及FN-α蛋白的表達(dá)量均有一定程度的減少。(3)Integrins及FNs表達(dá)模式檢測結(jié)果顯示:在RAW264細(xì)胞中,Integrin α2、Integrin α5、Integrin β1及Integrin β2四種蛋白具有一個相對較高的表達(dá)量,且Alpha Integrin 和 Beta Integrin 存在一定程度的相關(guān)性。而 Integrin α3、Integrin α5、Integrinβ1和Integrin β4該四種蛋白與FN-α蛋白具有一個較強(qiáng)的相互作用。(4)WesternBlot結(jié)果表明:在尼古丁作用36h時,Integrinβ1蛋白呈顯著的上調(diào),到72 h逐漸下調(diào);Integrin αv蛋白在尼古丁作用0 h到36 h逐漸下調(diào),48 h時呈顯著上調(diào);FN-3蛋白在尼古丁作用24 h時表達(dá)量下調(diào);FN-4蛋白在24 h和48 h時表達(dá)量上調(diào),72 h后顯著下調(diào);FN-F蛋白在尼古丁作用24 h時呈顯著的下調(diào),之后表達(dá)量相對穩(wěn)定,72 h后又下調(diào)。(5)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:Integrin β1蛋白在尼古丁作用24 h和48 h時表達(dá)量上調(diào),72h后下調(diào)(P0.001);Integrinαv蛋白在24h和36h時表達(dá)量上調(diào),之后趨于穩(wěn)定。結(jié)論:本課題利用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)、免疫熒光染色技術(shù)、掃描電鏡技術(shù)、Integrins表達(dá)模式檢測、Elisa、Western Blot和實時熒光定量PCR方法從細(xì)胞、蛋白及mRNA水平上探討尼古丁對巨噬細(xì)胞行為及功能的影響,以及Integrins和FNs兩種蛋白在巨噬細(xì)胞中功能改變的作用機(jī)制。結(jié)果表明該兩種蛋白可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的遷移過程,并具有一定的相關(guān)性,可為巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病的治療提供細(xì)胞水平的重要資料。
【學(xué)位單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

為了檢測尼古丁對原代巨噬細(xì)胞動態(tài)及行為的影響，我們利用高內(nèi)涵進(jìn)行活逡逑細(xì)胞追蹤，并采用高內(nèi)涵傳統(tǒng)分折方法分別對尼古丁處理前后原代巨噬細(xì)胞的動逡逑態(tài)及行為變化進(jìn)行分析。尼古丁處理前后原代巨噬細(xì)胞運(yùn)動軌跡的變化如圖３－１逡逑所示，在尼古丁處理之后，原代巨噬細(xì)胞的運(yùn)動有明顯被抑制的現(xiàn)象（圖３－１邋Ｂ）。逡逑尼古丁處理前后形態(tài)及動態(tài)變化分析如圖３－２所示，尼古丁處理后與對照組相比細(xì)逡逑胞的面積顯著減�。ǎ穑迹埃埃埃保�(xì)胞的長度顯著變短（Ｐ０．００１）（圖３－２邋Ａ和Ｄ）；逡逑細(xì)胞運(yùn)動的距離和運(yùn)動的速度相比對照組細(xì)胞也呈現(xiàn)顯著的縮短和減慢（Ｐ０．００１）逡逑（圖３－２邋Ｂ和Ｅ）；細(xì)胞運(yùn)動的轉(zhuǎn)角角度與對照組相比也具有極顯著的差異逡逑（Ｐ０．００１）（圖邋３－２Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｒ—，邐Ｂｅｆｏｒｅ邋Ｎｉｃ邐—邋Ａｆｔｅｒ邋Ｎｉｃ逡逑ｉ：｜S茫椋海昵劐義希靛危危危溴義希玻ǎ

本文編號：2810604