據世界衛(wèi)生組織(WHO)估計,全世界約有三分之一的人口感染了結核分枝桿菌。2009年,全球新發(fā)結核病例940萬例,死亡170萬例,結核病仍然是全球公共衛(wèi)生安全的重大威脅[1]。雖然結核病的發(fā)病率只有5%到10%,但由于龐大的感染人群,結核病現在仍然是僅次于艾滋病的全球第二大感染性疾病。從目前的流行趨勢來看,至2020年,結核病仍然會居于全球最嚴重的十大疾病之列。亞洲主要發(fā)展中國家,例如印度、中國、巴基斯坦和印度尼西亞集中了全球50%以上的結核病例,結核病防控形勢嚴峻。因此,對結核病致病機制的闡明進而為抗結核新藥和新疫苗開發(fā)奠定理論基礎就顯得尤為重要。 海分枝桿菌是近年來發(fā)展起來的研究結核分枝桿菌致病性的模式生物[2-10]。為了分離和鑒定海分枝桿菌新的毒力因子,我們通過對海分枝桿菌轉座子突變庫的篩選,我們得到了一些菌落形態(tài)發(fā)生改變的菌株,對菌株的插入位點進行鑒定后發(fā)現,有三株突變株的轉座子插入位點均位于同一基因內。這一基因為海分枝桿菌的ppe38(MMAR_3661)基因,與結核分枝桿菌ppe38(Rv2352c)基因的DNA序列相似性為82%,與PPE38蛋白的氨基酸序列相似性為73%。 PE (proline-glutamic acid)和PPE (proline-proline-glutamic acid)家族蛋白是分枝桿菌特有的蛋白,在致病性分枝桿菌中廣泛存在。前人的研究表明,這類蛋白可能定位于細胞壁或分泌到胞外,但它們在結核分枝桿菌致病性中發(fā)揮的功能還有待研究[11-19]。本研究對海分枝桿菌ppe38突變菌株的細菌生物學表型研究發(fā)現,突變株不僅菌落形態(tài)發(fā)生顯著改變,細菌沉積速率提高,遷移速率顯著降低,不能形成生物膜。所有的生物學表型在互補表達海分枝桿菌或結核分枝桿菌的PPE38蛋白后,都完全回復。Western blot結果發(fā)現,PPE38蛋白定位于分枝桿菌細胞壁。更有意思的是,PPE38突變后,海分枝桿菌典型的索狀結構特征消失。由于結核分枝桿菌致病菌H37Rv具有典型的索狀結構,而非致病菌H37Ra不具有索狀結構,所以幾十年來,索狀結構被認為是致病性分枝桿菌的典型結構[20]。而以往發(fā)現的與索狀結構形成相關的因子,均參與細胞壁脂質成分的合成。PPE38是一個新發(fā)現的索狀因子,證實了細胞壁蛋白在細菌索狀結構中起到的關鍵作用。 PPE38暴露于細胞壁表面提示其極易與宿主細胞相互作用。為了研究PPE38是否在分枝桿菌致病中發(fā)揮作用,我們利用斑馬魚感染模型,研究PPE38突變株的毒力改變。實驗結果表明,感染突變株的斑馬魚生存時間較野生組顯著延長。肝臟CFU計數表明突變株在斑馬魚體內的增殖速度低于野生株。組織病理學研究發(fā)現,在感染15天后,野生型感染組中出現大范圍組織壞死,完整的肉芽腫結構少見,大量海分枝桿菌播散至壞死組織區(qū)域,除肝臟外,腸絨毛和腹膜間隙也觀察到很多細菌。而突變株感染組在15天時,細菌多局限于完整的肉芽腫結構中,周圍組織壞死少見。提示PPE38在體內能夠導致組織壞死,從而加速細菌播散,加速斑馬魚死亡。 使用突變株感染巨噬細胞發(fā)現,突變株對巨噬細胞的侵染能力顯著降低。同時,突變株在巨噬細胞內的增殖速度減慢,對巨噬細胞的毒性減低。更進一步的,通過使用突變株或過表達PPE38蛋白的恥垢分枝桿菌侵染巨噬細胞,我們發(fā)現,PPE38蛋白能夠誘導促炎因子TNF-a和IL-6的表達。本研究表明PPE38蛋白能夠調節(jié)宿主免疫應答,是分枝桿菌重要的致病因子。(第一章) 通過對海分枝桿菌轉座子突變庫的篩選,我們發(fā)現一個突變株的菌落表型顯著改變。該突變株的突變位點位于MMAR_2340(pks5)和MMAR_2341之間。Real-time PCR結果表明,突變造成pks5基因表達下調20倍,而MMAR_2341表達無變化。由于pks5在脂質合成中起作用,突變株的細胞壁脂質合成可能發(fā)生改變。2D-TLC實驗證明,pks5突變株細胞壁脂質成分LOSs合成完全消失,而將pks5基因互補回突變株,其LOSs合成完全回復。LOSs是分枝桿菌重要的脂質成分,對LOSs功能的研究還不深入,有研究表明,純化的LOSs能夠抑制巨噬細胞TNF-α的分泌,提示LOSs可能類似于PGL,是分枝桿菌的毒力脂質[21]。 對pks5突變株研究發(fā)現,在LOSs缺失后,海分枝桿菌索狀結構改變,沉積速率提高,遷移能力減弱。同時,突變株對巨噬細胞的侵染能力下降,但突變株在巨噬細胞內的生長速率與野生型相比沒有顯著性差異。 為了研究LOSs是否在分枝桿菌致病性中發(fā)揮作用,我們使用斑馬魚感染模型,觀察LOSs突變株是否在斑馬魚體內減毒。實驗發(fā)現,pks5突變株感染的斑馬魚較野生型菌株感染的斑馬魚生存時間顯著延長。肝臟菌載量實驗表明,pks5突變株在斑馬魚體內增殖減慢。為了進一步證實LOSs是毒力因子,我們利用另一株LOSs的突變株1271(只合成LOSI),進行斑馬魚感染實驗,同樣發(fā)現1271在斑馬魚體內減毒,從而證明LOSs是海分枝桿菌重要的毒力脂質。(第二章) 分子流行病學是研究結核分枝桿菌傳播和種群進化的有力工具。研究表明,不同進化分支上的結核分枝桿菌在不同的國家和地區(qū)流行,不同基因型菌株的致病性和傳播力不盡相同。例如,一些細胞和動物模型證明在東亞流行的北京基因型菌株相比起其他基因型的菌株具有更高的毒力,能夠抑制宿主的免疫反應。 本研究根據3R基因(DNA Repair, DNA Recombination, DNA Replication;DNA修復,DNA重組,DNA復制相關基因)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP),構建了上海地區(qū)北京基因型菌株的進化樹[22]。將北京基因型菌株分為7個亞型(Bmyc2, Bmyc4, Bmyc6, Bmyc10, Bmyc13, Bmyc25和Bmyc26)。各亞型菌株的群體數量差異很大,其中一個新進化出的亞型(Bmyc10)在人群中占有主導地位,大于50%的北京基因型菌株屬于該亞群,提示該亞型的菌株在致病性和傳播力上可能比其它亞型具有一定優(yōu)勢。 為了研究北京基因型不同亞型菌株引起宿主免疫應答的差異,我們使用不同亞型的代表性菌株和非北京型菌株H37Rv,感染巨噬細胞,在不同的時間點收集細胞RNA,用Microarray研究巨噬細胞基因表達水平的差異。結果表明,通過對轉錄譜結果聚類分析發(fā)現,在感染后18小時,H37Rv能夠與北京基因型菌株分開,但北京基因型各亞型與成簇無相關性。對感染后的細胞上清中細胞因子進行檢測,也未發(fā)現各個菌株亞型之間的差異,提示北京基因型各亞型菌株引發(fā)的THP-1細胞免疫應答沒有顯著性差異。對13株分枝桿菌感染巨噬細胞后差異表達的基因進行轉錄調控分析可以發(fā)現,差異表達的大多數基因,受到轉錄調控因子STATs,Oct-1,IRF-1,IRF-7的調控,提示STATs,Oct-1,IRF-1和IRF-7在抗結核免疫中的關鍵作用。(第三章)
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R378.91

【共引文獻】

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本文編號：2807570