【摘要】：中腦多巴胺(DA)獎賞環(huán)路系統(tǒng)由中腦腹側被蓋區(qū)及其投射靶區(qū)伏隔核、前額葉皮層和杏仁核等組成。該獎賞系統(tǒng)可以參與與獎賞有關的抑郁及藥物成癮,也可以參與與獎賞無關的行為,如疼痛和厭惡等。中腦VTA投射到不同部位的DA能神經元在解剖分布、電生理特性和行為學相關性方面具有異質性。在電生理特性方面,投射到不同靶區(qū)的DA能神經元在放電頻率、動作電位時程、Ih電流大小和D_2R-GIRK調節(jié)機制參與程度等方面有所不同。這些投射特異性相關的異質性,更加體現(xiàn)了針對性研究VTA DA能神經元亞群的重要性。VTA DA能神經元主要有tonic(基礎張力)放電和burst(簇型)兩種自發(fā)放電模式,這些DA能神經元的放電模式可以影響DA的釋放及與VTA區(qū)相關的動物行為。有研究發(fā)現(xiàn),反復社交失敗壓力刺激下,小鼠VTA區(qū)DA能神經元的burst放電增加會引起DA釋放增多,誘發(fā)小鼠的抑郁樣行為。VTA區(qū)DA能神經元的興奮性可以被眾多膜受體(GABA受體和NMDA受體)和離子通道(鈣激活鉀通道,Kv7通道,G蛋白偶聯(lián)內向整流鉀通道)所調節(jié)。其中的鉀離子通道是調節(jié)VTA區(qū)DA神經元興奮性的重要因素之一,也是神經元興奮性產生和傳遞的基礎。DA介導的自抑制作用是調節(jié)DA神經元興奮性的重要機制。VTA區(qū)胞體樹突通過釋放DA激活自身D2受體進而影響神經元的興奮性,DA通過D2受體和與Gα_(i/o)蛋白相連的Kir3/GIRK家族的K~+通道起作用,引起細胞膜超級化,抑制神經元的興奮性。最近的研究表明,D_2R-Kir3/GIRK調節(jié)通路在投射到不同靶區(qū)的VTA DA神經元上的的表達不一樣。調節(jié)VTA區(qū)DA神經元的興奮性的另一個重要的K~+通道家族是Kv7/KCNQ通道。Kv7/KCNQ通道中的Kv7.2-7.5在中樞神經系統(tǒng)中都有表達。開放Kv7通道會使細胞膜超級化,抑制神經元的興奮性。Kv7家族中的Kv7.4亞型選擇性表達在VTA DA能神經元上。有研究發(fā)現(xiàn),Kv7通道可以作為一些疾病的治療靶點,如疼痛、癲癇、焦慮和藥物成癮等。在人們熟知的D_2R-Kir3/GIRK通路外,特別是GIRK通道表達較低的神經元上,Kv7通道是另一個影響VTA區(qū)DA神經元興奮性的機制。本研究主要探討Kv7.4和Kir3.2通道在調控投射到NAc和BLA的VTA區(qū)DA能神經元興奮性中的作用。第一部分投射到不同腦區(qū)的VTA區(qū)多巴胺能神經元的異質性目的:觀察投射到不同腦區(qū)的VTA區(qū)DA能神經元的異質性方法:利用逆行性示蹤和免疫組化技術,確定投射到各腦區(qū)的DA能神經元在VTA區(qū)的分布;利用電生理貼附式膜片鉗技術,研究VTA的各投射靶區(qū)的多巴胺能神經元電生理特性的差異;利用單細胞PCR技術,觀察投射到不同腦區(qū)的VTA DA能神經元標識物的不同,以及Kv7.4和Kir3.2離子通道在VTA DA能神經元的表達。結果:(1)投射到各個腦區(qū)的多巴胺能神經元在VTA的分布:免疫組織共染結果表明,投射到NAc的VTA DA能神經元主要分布在內側黑質旁核(PN)和臂旁色素核(PBP)核,投射到mPFC的VTA DA神經元主要位于靠近中線的束間核(IF),而投射到BLA的VTA DA神經元在整個臂旁色素核散在分布。投射到NAc和BLA的VTA神經元絕大多數(shù)存在逆行性示蹤劑與TH抗體的共標,表明投射到這兩個腦區(qū)的神經元大部分是多巴胺能神經元。(2)不同靶向投射的多巴胺能神經元的電生理差異:野生型小鼠中,投射到NAc和BLA的VTA DA神經元的放電頻率低于投射到mPFC的VTA DA神經元的放電頻率(P0.05)。投射到NAc的動作電位時程,明顯短于投射到mPFC的動作電位時程(P0.05)。(3)DA和baclofen對VTA投射到各個靶區(qū)的多巴胺能神經元興奮性的影響:用細胞貼附式記錄結果表明,DA(20μM)能抑制投射到NAc和BLA的多巴胺能神經元的放電(P0.05),而對投射到mPFC的神經元放電頻率沒有影響(P0.05);應用baclofen(10μM)后,各投射靶區(qū)(NAc core,mPFC和BLA)的多巴胺能神經元放電頻率明顯小于給藥前的放電頻率(P0.05)。(4)單細胞PCR結果:投射到NAc和BLA中80% 95%的神經元表達TH和DAT mRNA,大多數(shù)是多巴胺能神經元。相比之下,投射到mPFC小于30%的神經元表達TH,但是沒有DAT表達。D2受體的mRNA在投射到NAc(82%)和BLA(62%)的VTA DA神經元上高表達,而在投射到mPFC的VTA DA神經元沒有表達。投射到三個腦區(qū)的VTA神經元中,大約50%-70%有Kv7.4的表達,相應的在60%~90%神經元中有明顯的Kir3.2通道的表達。結論:(1)投射到NAc和BLA的VTA DA神經元的放電頻率低于投射到mPFC的VTA DA神經元的放電頻率。(2)DA可以抑制投射至NAc和BLA的VTA DA能神經元的興奮性,對投射至mPFC的神經元沒有作用。(3)Kir3.2和Kv7.4在投射至各靶區(qū)的VTA DA神經元中的表達沒有不同,多巴胺能標記物TH、DAT和D2在投射至NAc和BLA的神經元上大量表達,而在投射至mPFC的神經元上表達明顯減少。第二部分Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神經元的自抑制中的作用目的:觀察Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神經元興奮性調控中的作用方法:利用mRNA原位雜交和免疫熒光技術,觀察Kv7.4和Kir3.2在VTA區(qū)的表達;利用離體腦片膜片鉗貼附和全細胞記錄技術,觀察野生型小鼠、Kv7.4~(-/-)鼠、Kir3.2~(-/-)鼠和Kv7.4~(-/-)/Kir3.2~(-/-)小鼠中,調控Kv7.4和Kir3.2功能對VTA-NAc投射通路中VTA DA能神經元興奮性的影響。結果:(1)原位雜交和免疫組合結果顯示,VTA區(qū)TH抗體免疫陽性神經元中均有Kv7.4和Kir3.2通道的表達。(2)Kv7.4和Kir3.2通道對VTA投射到NAc的神經元中DA引起的自抑制作用的影響:DA(20μM)顯著降低VTA DA神經元在野生型小鼠(P0.05),Kv7.4~(-/-)小鼠(P0.05)、Kir3.2~(-/-)小鼠(P0.05)和Kv7.4~(-/-)/Kir3.2~(-/-)(P0.05)小鼠上VTA-NAc投射通路中的平均放電頻率。野生型小鼠中,DA誘導的自抑制作用大多數(shù)可以被XE991逆轉(P0.05);在Kv7.4~(-/-)小鼠中,XE991不能顯著逆轉DA的自抑制作用;在Kir3.2~(-/-)小鼠中,XE991可部分翻轉DA的作用(P0.05)。Tertiapin-Q能部分阻斷野生型(P0.05)和Kv7.4~(-/-)小鼠(P0.05)中DA引起的自抑制作用,但是在Kir3.2~(-/-)小鼠中沒有明顯作用(P0.05)。野生型小鼠中83%(19/23)的神經元,Kv7.4~(-/-)小鼠中71%(17/24)的神經元和Kir3.2~(-/-)小鼠中43%(10/23)和Kv7.4~(-/-)/Kir3.2~(-/-)小鼠中20%(2/10)的神經元的放電可被DA完全抑制。(3)DA可以激活神經元的Kv7/M和Kir3/GIRK電流:野生型小鼠中,DA(20μM)使M樣電流從71.0±13.6 pA增大至93.0±15.1 pA(P0.05);XE911(3μM)使M樣電流從93.0±15.1 pA降低至39.0±7.1 pA(P0.05),而在Kv7.4~(-/-)小鼠中,XE991增大M樣電流的作用消失。同樣,tertiapin-Q可以阻斷野生型小鼠上DA引起的Kir3/GIRK電流(P0.05),而在Kir3.2~(-/-)小鼠上給予DA后Kir3/GIRK電流無明顯增加(P0.05)。結論:(1)Kv7.4及Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神經元的自抑制中發(fā)揮重要作用,共同構成其自抑制作用的機制。(2)除了Kv7.4和Kir3.2通道外,還有其他離子機制參與VTA DA神經元興奮性的自調節(jié)作用。第三部分Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中DA能神經元的自抑制中的作用目的:觀察Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中對DA能神經元興奮性調控中的作用方法:利用離體腦片膜片鉗貼附和全細胞記錄技術,觀察野生型小鼠、Kv7.4~(-/-)和Kir3.2~(-/-)小鼠中,調控Kv7.4和Kir3.2功能對VTA-BLA投射通路中VTA DA能神經元興奮性的影響。結果:(1)Kv7.4和Kir3.2對VTA投射到BLA的神經元中DA引起的自抑制作用的影響:同第二部分結果類似,應用DA(20μM)后,VTA-BLA投射通路中DA神經元的平均放電頻率在野生型小鼠(P0.05),Kv7.4~(-/-)小鼠(P0.05)和Kir3.2~(-/-)小鼠(P0.05)上能夠顯著降低。野生型小鼠中,XE991可以逆轉大多數(shù)神經元中DA誘導的自抑制作用(P0.05);Kv7.4~(-/-)小鼠中,DA的自抑制作用不能被XE991顯著逆轉;Kir3.2~(-/-)小鼠中,XE991可部分翻轉DA的作用(P0.05)。用同樣的方法,tertiapin-Q代替XE991,結果顯示tertiapin-Q能部分阻斷野生型(P0.05)和Kv7.4~(-/-)小鼠(P0.05)中DA引起的自抑制作用,但是在Kir3.2~(-/-)小鼠中沒有明顯作用(P0.05)。(2)DA可以激活VTA-BLA投射通路中DA能神經元的Kv7.4/M和Kir3.2/GIRK電流:在野生型小鼠VTA區(qū)域的DA神經元中,DA(20μM)使M樣電流從58.8±10.3 pA增大至85.0±9.4 pA(P0.05);XE911(3μM)使M樣電流從85.0±9.4 pA降低至33.8±4.3 pA(P0.05),而在Kv7.4~(-/-)小鼠中,DA增大M樣電流的作用消失(67.5±8.8 p A至71.8±10.8 pA)。同樣,tertiapin-Q(300 nM)可以阻斷野生型小鼠上DA引起的Kir3/GIRK電流(-286.3±55.4 pA降低至-207.5±50.6 pA,P0.05),而在Kir3.2~(-/-)小鼠上DA沒有作用(-225±26.0 p A至-240±31.8 pA,P0.05)。結論:Kv7.4及Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中DA能神經元的自抑制中發(fā)揮重要作用,共同構成其自抑制作用的機制。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R338
【圖文】：

28圖 2 不同靶向投射的 VTADA 能神經元的電生理特性的差異Fig. 2 The projection-specific electrophysiological parameters of VTA Dneurons(A) Example traces of spontaneous firing of VTA DA neurons projectindifferent targets. The firing of the action potential was recorded uextracellular loose patch recording method. Right panel showed the exacharacteristic DA neuron action potential (AP) waveform from VTA slicvitro. Dotted lines represent the margins of the AP width, and the paramfrom the onset to the negative deflection peak was set at >1.1 ms, whichto be considered one of characteristics of DA neurons. (B) Summarized ffrequency of VTA DA was presented. (C) Summarized action potential

DA和baclofen對VTA投射到各個腦區(qū)的VTADA神經元興奮性的影響

投射到不同腦區(qū)的VTADA神經元的單細胞PCR分析

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本文編號：2806558