【摘要】：小鼠免疫系統(tǒng)與人類免疫系統(tǒng)在結構以及功能上非常相似,因此研究人員利用小鼠模型深入的研究了人體免疫系統(tǒng)的相關功能。但是,由于種屬特異性的存在,在疾病致病機制、病原感染等方面,小鼠產(chǎn)生的免疫反應過程與人體產(chǎn)生的免疫反應過程差異顯著。其中一個原因是MHC限制性差異,人類MHC分子為HLA,小鼠MHC分子為H-2。由于無法消除小鼠與人類間不同的特異性而導致的影響,因此很多基礎研究中,無法有效地反映人體免疫系統(tǒng)的特征,進而影響臨床實驗研究,無法復制臨床前實驗動物的結果。而構建能夠模擬人體免疫反應的人源化小鼠,可更有效的幫助人們了解疾病的致病機制以及疫苗、藥物的研究,并提高臨床前實驗研究結果的準確性。MHC分子具有高度的多態(tài)性,同時各人群優(yōu)勢單倍型也有特征性分布,因此也導致了人群中各種各樣的個體存在,為了抵御環(huán)境變化和病原入侵,某一群體會有相同或相似的MHC分子。這樣導致某一種族,某一群體中MHC優(yōu)勢基因不盡相同,有著明顯的差異。中國人群中,MHC-I類分子中,HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24是優(yōu)勢亞型,但是歐洲人群以HLA-A2、HLA-A3和HLA-A1為主。在MHC-II類單倍型中,HLA-DR15在中國人群中占25%以上,HLA-DR1單倍型在中國人群中占的比例在10%~15%。而歐洲人群以及中東地區(qū)人群中,HLA-DR1、HLA-DR3和HLA-DR4為優(yōu)勢存在的單倍型。目前構建的人MHC轉基因小鼠模型的策略是將外源HLA基因整合入小鼠基因組后,同時敲出小鼠內源的H-2基因的重要組分。此種策略構建的MHC轉基因小鼠模型具有人MHC限制性反應特征,能夠有效的應用于人類病原表位的篩選鑒定以及疫苗研發(fā)和評價等研究中。埃博拉病毒是一類絲狀病毒,在人類和非人類靈長類動物中都會導致高死亡率的烈性傳染病。2014年非洲地區(qū)發(fā)生埃博拉病毒最大規(guī)模的一次疫情暴發(fā)。盡管國內外已經(jīng)進行了大量摸索及研究,但仍沒有有效的治療方法或臨床應用的抗埃博拉病毒的疫苗。近年來,隨著科學家們對埃博拉病毒蛋白質組學的深入研究,發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒核蛋白是病毒主要結構蛋白之一,其在病毒復制和包裝過程有重要作用,而且具有感染免疫保護作用�；诎２├《竞说鞍�,結合生物信息技術分析、預測和鑒定病毒表位,設計多肽表位疫苗,這也是病毒疫苗研發(fā)的新的技術途徑之一。本論文首先是構建一種新型具有中國人群優(yōu)勢HLA-I類和HLA-II類單倍型的HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠模型,并以實驗室前期構建的具有中國人群優(yōu)勢HLA-I類及HLA-II類單倍型的HLA-A11/DR1雙轉基因小鼠進行埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位的篩選和鑒定研究。1.人MHC(HLA-A2/DR15)雙轉基因小鼠模型制備及功能分析將鼠源H-2-Iaβ的啟動子和非編碼區(qū)替換HLA-DRB1*15:01基因的啟動子和非編碼區(qū),優(yōu)化后的HLA-DRB15轉基因載體顯微注射將其整合到受體小鼠的基因組后,移植胚胎到代孕母鼠體內,獲得HLA-DRB15首建鼠。將首建鼠與HLA-A2~(+/+)/DR1~(+/+)/H-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)雙轉基因小鼠進行雜交,并通過10代以上的自交和回交,獲得可穩(wěn)定遺傳的HLA-A2~(+/+)/DR15~(+/+)/H-2-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)雙轉基因小鼠。通過基因檢測HLA-A2基因和HLA-DR15基因在轉小鼠模型基因組中表達,以及鼠源H-2基因的表達沉默;通過流式細胞術檢測HLA-A類基因和HLA-DR類基因在HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠脾細胞表面的表達明顯高于對照組C57BL/6小鼠中的表達;并且,在雙轉基因小鼠體內也檢測到了相對正常比例和數(shù)量的CD8~+T細胞和CD4~+T細胞,表明外源HLA分子能夠在轉基因小鼠體內,經(jīng)過胸腺的陰性和陽性的選擇,進而發(fā)育成為成熟的T細胞后,行使其相應細胞免疫功能。利用構建的重組腺病毒Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠或對照組C57BL/6小鼠,三次免疫后發(fā)現(xiàn),HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠體內的IgG抗體水平與對照組C57BL/6小鼠體內的抗體水平基相近,證明雙轉基因小鼠具有相對正常的體液免疫反應應答。通過生物信息學分析合成9個HLA-DR15限制性Th表位肽,其中AL-15、KA-15、FV-15、KS-15、YN-15和HA-15刺激免疫后的HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠的脾細胞可產(chǎn)生大量IFN-γ,顯著強于免疫后的野生型小鼠產(chǎn)生的IFN-γ,證明該轉基因小鼠具有HLA-DR15限制性細胞免疫應答功能。以上結果表明,本研究成功制備了一種具有中國人群優(yōu)勢MHC限制性特征的HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠模型。該模型可用于病原抗原HLA-DR15限制性表位的篩選鑒定、疫苗藥物的研發(fā)以及疾病致病機制等研究。2.埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位篩選與鑒定本研究以埃博拉病毒核蛋白基因為研究對象,合成EBOV-NP基因序列,將其克隆到穿梭載體pShuttle-CMV中,線性化的穿梭質粒轉化到BJ5183感受態(tài)細胞后進而重組到腺病毒系統(tǒng)的骨架質粒中。利用Pac I限制性內切酶酶切后,轉染到AD-293包裝細胞內�；谙俨《鞠嚓P的細胞病變效應鑒定轉染的細胞,然后將重組Ad5-EBOV-NP病毒在AD-293細胞中再擴增并純化。為了檢測重組病毒的表達,用純化的Ad5-EBOV-NP制備物感染AD-293細胞并在熒光顯微鏡下觀察,以及用Western Blot方法可檢測到EBOV-NP蛋白表達。利用重組腺病毒Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A11/DR1轉基因小鼠和野生型C57BL/6。每次免疫后收集血清,利用ELISA方法檢測轉基因小鼠體內IgG抗體應答。結果顯示,三次免疫后,Ad5-EBOV-NP分別免疫轉基因小鼠體內的抗體水平與對照組C57BL/6小鼠體內的抗體水平無顯著差異;而Ad5-EBOV-NP免疫的轉基因小鼠的抗體滴度顯著高于對照重組腺病毒Ad5免疫的轉基因小鼠的滴度。同時,利用生物信息技術分析和預測了EBOV-NP蛋白的HLA-A11限制性表位肽,基于預測的HLA-A11結合程度和常規(guī)疏水性,合成10個結合力較高的表位肽。分別用Ad5-EBOV-NP或Ad5免疫HLA-A11/DR1雙轉基因小鼠,利用ELISPOT方法檢測發(fā)現(xiàn)10個多肽中有6個多肽,即GR-9、VR-9、QR-9、EK-9、PK-9和RK-9可誘導Ad5-EBOV-NP免疫小鼠的脾細胞產(chǎn)生的大量IFN-γ,比Ad5免疫的轉基因小鼠誘導脾細胞產(chǎn)生的IFN-γ高4倍以上。進一步驗證得到的6個表位是HLA-A11限制性的T細胞表位,用Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A11/DR1或C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn),其中GR-9、VR-9、EK-9、PK-9和RK-9這5個多肽可刺激Ad5-EBOV-NP免疫的轉基因小鼠脾細胞產(chǎn)生顯著強于免疫后的野生型小鼠脾細胞產(chǎn)生的IFN-γ。因此,利用HLA-A11/DR1小鼠鑒定得到了EBOV-NP蛋白中的5個新型HLA-A11限制性CTL表位,而QR-9由于在轉基因小鼠和野生型小鼠均能產(chǎn)生細胞免疫反應,因此該表位肽并非HLA-A11特異性的。本研究成功制備新型HLA-A2/DR15雙轉基因小鼠模型,并證明其具有正常體液免疫反應及HLA-DR15限制性細胞免疫反應功能,該模型為抗原表位的篩選鑒定及新型疫苗、藥物的研究提供了一種新技術手段。同時,利用HLA-A11/DR1雙轉基因小鼠模型進行了EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性CTL表位的篩選鑒定,獲得5個EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性表位,為埃博拉病毒表位篩選鑒定及新型疫苗研究提供了新的基礎。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373
【圖文】：

軍事科學院博士學位論文1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 HLA-DRB15 基因的合成與克隆參 照 GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 獲 取 的 HLA-DRB1*15:01 基 因 核 苷 酸 序 列（GenBank:HM067861.1），利用生物信息學綜合分析基因密碼子組成，GC 含量、正向重復序列和反向重復序列等進行核苷酸序列優(yōu)化后的 HLA-DRB15 基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因長度為 3136bp，如圖 1.1 所示，其中包括的小鼠 H-2-IAβ的啟動子序列、5`非編碼區(qū)、優(yōu)化后的 HLA-DRB1*15:01序列以及 3`非編碼區(qū)，并分別在序列的上游和下游添加酶切位點 Hind III，克隆到pET-32a 載體上。

軍事科學院博士學位論文.實驗結果制備 HLA-A2/DR15 雙轉基小鼠模型的策略是同時將外源 HLA-A2 分子與LA-DR15 分子整合到野生型小鼠基因組，同時沉默 H-2-β2m 分子和 H-2-Iaβ分子功能，這樣得到的轉基因小鼠同時具有 HLA-A2 限制性和 HLA-DR15 限制性。驗室前期已經(jīng)獲得 HLA-A2/DR1（HLA-A2+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-）雙轉基因鼠，由于 HLA-DR 分子具有相同的α鏈，該轉基因小鼠可提供 HLA-A2 分子的同也可提供 HLA-DRA 基因。因此，本研究首先構建 HLA-DRB15 轉基因小鼠，其與 HLA-A2/DR1 雙轉基因小鼠進行雜交，獲得 HLA-A2/DR15 雙轉基因小鼠型。制備示意圖如圖 1.2 所示。

圖 1.3 pET-32a-DRB15 酶切鑒定B15質粒； 2：pET-32a-DRB15酶切結3：Trans 15K DNA Marker 1.4 pET-32a-DRB15 重組質粒 PCR 鑒 pET-32a-DRB15； 2：5×10-2ng pET-32

【參考文獻】

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1 孫繼麗;杜可明;傅敏;孫瑛;金曄;謝軍華;季蕓;楊健豪;稽月華;張錚;毛臻;劉達莊;錢開誠;;20596名漢族造血干細胞供者HLA多態(tài)性統(tǒng)計學分析[J];中國輸血雜志;2006年05期

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1 曾揚;人MHC轉基因小鼠模型建立及其應用基礎研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2016年

本文編號：2803965