【摘要】：目的:通過體外包裝高滴度PTPRR基因過表達和PTPRRsh RNA慢病毒顆粒,將病毒顆粒經(jīng)小鼠腦立體定位術(shù)注入小鼠海馬區(qū),構(gòu)造PTPRR基因過表達和沉默小鼠模型,比較基因過表達及基因沉默小鼠在懸尾實驗、糖水實驗、強迫游泳實驗中抑郁相關(guān)的行為變化,進一步聯(lián)合慢性不可預(yù)知刺激(CMS)方法觀察小鼠抑郁行為的改變,初步探討動物模型中PTPRR基因與抑郁發(fā)生的關(guān)系。方法:1.首先將已構(gòu)建成功的PTPRR基因過表達載體及空白對照載體GFP、PTPRRsh RNA載體及空白對照載體sh GFP,轉(zhuǎn)染至293T細胞進行包裝,濃縮產(chǎn)生適用于體外實驗的高滴度病毒顆粒。2.采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬區(qū)微量注射慢病毒顆粒,從而引起小鼠海馬區(qū)PTPRR基因過表達及基因沉默,實驗28天后取新鮮海馬組織,采用Western-blot、RT-PCR的方法分別檢測小鼠海馬區(qū)PTPRR蛋白及PTPRRm RNA表達改變。3.80只C57BL/6J小鼠隨機分為10組,每組8只,分別為:①Lenti-sh PTPRR(PTPRR基因沉默)組;②lenti-sh GFP(低表達空載體)組;③Lenti-PTPRR(PTPRR基因過表達)組;④lenti-GFP(高表達空載體)組;⑤control(正常對照)組;⑥Lenti-sh PTPRR+CMS(PTPRR基因沉默干預(yù))組;⑦lenti-sh GFP+CMS(空載體干預(yù))組;⑧Lenti-PTPRR+CMS(PTPRR基因過表達干預(yù))組;⑨lenti-GFP+CMS(高表達空載體干預(yù))組;⑩control+CMS(正常對照干預(yù))組。小鼠術(shù)后1周,第⑥-⑩組進行CMS干預(yù)21天后,觀察比較各組小鼠抑郁行為的變化。結(jié)果:1.成功建立具有特異性的PTPRR高表達及PTPRRsh RNA病毒包裝顆粒,病毒滴度達到1x109TU。2.注射病毒28天后發(fā)現(xiàn),Lenti-PTPRR組小鼠海馬組織PTPRRm RNA及蛋白水平與control組和Lenti-GFP組明顯增高(P0.001);Lenti-PTPRRsh RNA組小鼠海馬組織PTPRRm RNA及蛋白水平較control組和Lenti-sh GFP組明顯降低(P0.001);而Lenti-GFP組與control組兩組間比較,Lenti-sh GFP組與control組兩組間比較,PTPRRm RNA及蛋白水平無顯著性差異(P0.05)。3.在強迫游泳實中,各組間不動時間具有顯著差異(F=28.823),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進行T檢驗,小鼠不動時間明顯延長(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進行T檢驗,強迫游泳不動時間無顯著性改變(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,強迫游泳時間明顯延長(P0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,強迫游泳時間明顯減少(P0.001)。4.在懸尾實驗中,各組間具有顯著性差異(F=10.215),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進行T檢驗,小鼠不動時間無明顯差異(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進行T檢驗,不動時間明顯減少(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,不動時間無明顯改變(p0.05);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,強迫游泳時間明顯減少(P0.001)。5.在糖水實驗中,各組間存在顯著性差異(F=16.19),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗無顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進行T檢驗,小鼠糖水消耗率存在明顯降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進行T檢驗,糖水消耗率未有明顯改變,無統(tǒng)計差異(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,糖水消耗明顯降低,存在統(tǒng)計差異(p0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進行T檢驗,糖水消耗明顯降低,統(tǒng)計具有差異(P0.001)。結(jié)論:1.成功包裝產(chǎn)生PTPRR過表達和PTPRRsh RNA高滴度慢病毒顆粒;2.成功建立PTPRR基因過表達和基因沉默小鼠模型;3.PTPRR過表達可以引起小鼠抑郁行為的增加,PTPRR基因過可能對于應(yīng)激更為敏感;4.PTPRR基因沉默可能會改善抑郁小鼠的絕望行為。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R749.4
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果.1 PTPRR 基因過表達和 shRNA 病毒的包裝.1.1 實時熒光定量 PCR 檢測包裝病毒在 293T 細胞的表達經(jīng)實時熒光定量 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，本實驗所包裝的 PTPRR 過表達病毒顆粒（圖中示：PTPRR 組）較其空白載體（圖中所示：GFP）在 293T 細胞中 PTPRRmRNA達明顯升高；包裝的四種 PTPRR 基因沉默病毒顆粒（圖中所示：shPTPRR1、hPTPRR2、shPTPRR3、shPTPRR4）較其空載體（圖中所示：shGFP 組）在 293T 細中 PTPRRmRNA 表達明顯降低。

20滴度：10-5滴度：10-6圖2-2 293T細胞免疫熒光結(jié)果(x20)2.2 PTPRR 基因過表達及基因沉默小鼠的驗證2.2.1 小鼠海馬注射 28 后，海馬區(qū) PTPRRmRNA 的表達使用 RT-PCR 的方法檢測各組小鼠海馬區(qū) PTPRRmRNA 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lenti-GFP、Lenti-shGFP 與空白組比較，PTPRRmRNA 表達無顯著差異（P>0.05）

統(tǒng)計具有差異（p＜0.01）；PTPRR 基因過表達組小鼠較其空載體對照組小鼠，海馬區(qū) PTPRRmRNA 明顯下降，統(tǒng)計具有差異（p＜0.01）。圖2-3 病毒注射28后，PTPRRmRNA在小鼠海馬的表達2.2.2 小鼠海馬注射 28 后，海馬區(qū) PTPRR 蛋白的表達使用 Western-blot 的方法檢測各組小鼠海馬區(qū) PTPRR 蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PTPRR 基因沉默組小鼠較其空載體對照組小鼠，Lenti-GFP、Lenti-shGFP 與空白組比較，PTPRRmRNA 表達無顯著差異（P>0.05）；海馬區(qū) PTPRR 蛋白水平明顯下降，統(tǒng)計具有差異（p＜0.01）；PTPRR 基因過表達組小鼠較其空載體對照組小鼠，海馬區(qū) PTPRR 蛋白水平明顯下降

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 石翠娟;張克讓;許琪;;受體型蛋白酪氨酸磷酸酶R基因多態(tài)性與重性抑郁障礙的關(guān)聯(lián)分析[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2011年06期

本文編號：2801477