【摘要】：肺炎鏈球菌是引起人類疾病的重要病原菌之一,可引起大葉性肺炎、腦膜炎、支氣管炎等疾病,導致全球每年約160萬人死亡。肺炎鏈球菌主要的致病因子包括肺炎鏈球菌磷壁酸、溶血素及細胞壁莢膜。膽堿是肺炎鏈球菌細胞壁和夾膜的重要組分,同時也是其生長必須的營養(yǎng)成分。膽堿對肺炎鏈球菌的分裂、轉化、自溶以及膽堿結合蛋白的形成具有至關重要的作用。肺炎鏈球菌的膽堿合成代謝途徑主要由lic基因簇編碼的8個蛋白質構成。肺炎鏈球菌膽堿合成代謝通路的研究有助于我們更好地理解其致病機制,同時對于新型抗菌藥物的研制具有重要的指導意義。 LicA是肺炎鏈球菌膽堿激酶,催化ATP和膽堿反應生成ADP和磷酸膽堿。我們通過X射線晶體學的方法解析了LicA的apo-form以及LicA與choline、AMP和ADP復合物晶體結構,衍射分辨率分別為1.94A,2.01A,1.45A和1.86A。LicA的底物結合位點分析以及底物結合相關氨基酸的突變酶活實驗揭示了對于催化可能起關鍵作用的殘基。通過復合物結構與apo-form的結構比對我們發(fā)現(xiàn)LicA在底物結合以及產(chǎn)物生成時都伴隨著誘導契合的構象變化。同源結構比對和序列分析顯示LicA與真核膽堿激酶相比在膽堿結合口袋附近的loop α7-α8缺失,這導致LicA酶催化速率降低。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)抑制劑HC-3在體外對于LicA的酶活有一定的抑制效果,同時在體內(nèi)也能影響肺炎鏈球菌的生長和分裂。這些結果為新型抗菌藥物的研究提供了一定的理論依據(jù)。 LicD2是肺炎鏈球菌的磷酸膽堿轉移酶,以CDP-choline作為底物供體,以磷壁酸上的GalNAc作為底物受體,將磷酸膽堿轉移到磷壁酸形成磷脂酰膽堿。LicD2作為一個膜結合蛋白,在大腸桿菌重組表達過程中定位在細胞膜上,因此重組LicD2采用膜蛋白方法進行純化。純化過程中對于去垢劑的摸索發(fā)現(xiàn)利用磷脂酰膽堿類似物型去垢劑Fc-12純化獲得的蛋白狀態(tài)最優(yōu)。我們通過熒光光譜實驗分別測定了LicD2與CDP-choline和GalNAc的結合解離常數(shù)約為145μM和34μM同時,對LicD2及其底物復合物晶體進行了初步研究,并獲得了一些晶體生長條件,為后續(xù)的LicD2結構與催化機制研究提供一定的理論依據(jù)。 肺炎鏈球菌膽堿激酶LicA和磷酸膽堿轉移酶LicD2的結構和功能研究有助于我們更好地理解其致病機制,同時對于新型抗菌藥物的研制具有重要的指導意義。
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378;Q55
【圖文】：

體呈矛頭狀，直徑約為1 fim,多成雙排列，寬端相對，尖端相背，無鞭毛，不形成芽孢（圖1.1)。有毒菌株具有較厚的莢膜，莢膜成分主要為具有抗原性的多糖，普通染色時莢膜不著色，表現(xiàn)為菌體周圍透明環(huán)狀物，利用釕紅對莢膜進行染色可以在電鏡下觀察莢膜的形態(tài)。弱毒菌株的莢膜較薄或缺失，如:R6菌株。菌體在衰老時或者由于自溶素（autolysin)的產(chǎn)生引起細菌肽聚糖發(fā)生水解時，又可以呈現(xiàn)革蘭氏染色陰性。 、??? ?~

本文編號：2801333