【摘要】：目的:血吸蟲(chóng)病是全球最常見(jiàn)的人獸共患病之一,血吸蟲(chóng)卵為血吸蟲(chóng)致病和流行的最關(guān)健因子,因此,掌握血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育與產(chǎn)卵的生物學(xué)分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)可供干預(yù)的關(guān)鍵靶點(diǎn),對(duì)于制定預(yù)防和治療這些感染的新策略至關(guān)重要。TK3是細(xì)胞酪氨酸激酶家族的成員,曼氏血吸蟲(chóng)Sm TK3主要定位于血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的卵黃腺和卵母細(xì)胞以及雄蟲(chóng)的精原細(xì)胞中,推測(cè)其可能參與曼氏血吸蟲(chóng)的生殖活動(dòng),然而日本血吸蟲(chóng)TK3在其生殖過(guò)程中的作用卻尚不明確。本研究的目的是探討TK3在日本血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育中的作用。方法:根據(jù)SmTK3設(shè)計(jì)引物,以日本血吸蟲(chóng)cDNA為模板,擴(kuò)增獲得日本血吸蟲(chóng)Sj TK3全長(zhǎng)序列。用DNAMAN軟件分析其氨基酸序列,了解Sj TK3蛋白在各個(gè)物種中的同源,利用MEGA5軟件建立了Sj TK3詳細(xì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用TRIzol方法提取蟲(chóng)體總RNA,用熒光定量PCR的方法分別檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、尾蚴、童蟲(chóng)期、24天雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)以及42天雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)Sj TK3的表達(dá)情況。Dihydrochloride是一種Src激酶抑制劑,在體外應(yīng)用于日本血吸蟲(chóng)。Dihydrochloride處理日本血吸蟲(chóng)7天后,收集血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵,觀察不同處理量的實(shí)驗(yàn)組與空白組蟲(chóng)卵的數(shù)量變化;同時(shí)利用共聚焦激光掃描顯微鏡下拍攝血吸蟲(chóng)生殖器官形態(tài)圖片并分析。最后使用q PCR分析了一些與蟲(chóng)卵形成相關(guān)基因的變化情況。結(jié)果:利用PCR擴(kuò)增出Sj TK3基因全長(zhǎng),經(jīng)測(cè)序和初步分析該基因共編碼647個(gè)氨基酸。用TK3所在幾個(gè)代表物種構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),通過(guò)對(duì)進(jìn)化樹(shù)的觀察,日本血吸蟲(chóng)此基因與其他物種TK3基因并為一條進(jìn)化支,因此確認(rèn)日本血吸蟲(chóng)TK3基因?qū)儆赟rc家族成員,通過(guò)DNAMAN軟件分析TK3蛋白同源性,發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)TK3蛋白與曼氏血吸蟲(chóng)TK3蛋白(即Sj TK3和Sm TK3)同源性很高,為91.6%,故將其命名為日本血吸蟲(chóng)Sj TK3。Sj TK3 m RNA在日本血吸蟲(chóng)的生活史各個(gè)階段中呈現(xiàn)差異表達(dá)。在Src抑制劑Dihydrochloride處理后,激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果顯示,在日本血吸蟲(chóng)的生殖器官,尤其是在雌蟲(chóng)的卵巢和雄蟲(chóng)的睪丸,其生殖細(xì)胞形態(tài)有所改變,可觀察到孔狀結(jié)構(gòu);隨Dihydrochloride處理的濃度上升,分別加入25μM,50μM,75μM的量,在處理第7天時(shí)用普通光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵數(shù)量,發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)量在50μM,75μM濃度處理下各下降了約18%和31%,此外,在Dihydrochloride處理后第7天,一些重要的蟲(chóng)卵形成相關(guān)基因(P14,P48和Fs800)的表達(dá)水平也發(fā)生了變化。結(jié)論:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)我們推斷,Sj TK3在日本血吸蟲(chóng)生殖器官的成熟和蟲(chóng)卵的發(fā)育和產(chǎn)生中發(fā)揮相當(dāng)重要的功能。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更好地了解日本血吸蟲(chóng)的生殖生物學(xué),發(fā)現(xiàn)調(diào)控日本血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育信號(hào)通路中的重要分子,通過(guò)干預(yù)其關(guān)鍵靶點(diǎn)從而有效抑制血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育,可實(shí)現(xiàn)對(duì)血吸蟲(chóng)致病和流行進(jìn)行有效的控制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R383.24

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡昌仁;日本血吸蟲(chóng)的形態(tài)、生活史及各期生物學(xué)特性[J];實(shí)用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志;1995年01期

本文編號(hào)：2794164