【摘要】：作為一種擁有多潛能功能的干細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs),在各個時期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,均可以維持自我更新增殖的能力,從而具備干性;在胚胎發(fā)育階段和成年時期的腦中均能啟動分化從而形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞等具有不同功能、成熟的神經(jīng)細(xì)胞。目前,NSCs的自我更新、分化命運(yùn)轉(zhuǎn)變與決定機(jī)制是干細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究中最重要的科學(xué)問題。NSCs的自我增殖能力、干性維持能以及向分化命運(yùn)的啟動,是通過對不同時期、階段特定的轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控而實現(xiàn)的。因此,如何準(zhǔn)確的對調(diào)控NSCs自我更新能力、以及對決定分化命運(yùn)轉(zhuǎn)換分子機(jī)制的確定,從而為胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常以及成體神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防、治療提供一定的幫助,這方面的相關(guān)研究成為神經(jīng)干細(xì)胞領(lǐng)域中的一個重要的科學(xué)問題。NSCs在受到分化信號刺激時可以表達(dá)分化命運(yùn)決定因子MAP2、GFAP和NG2等,從而退出細(xì)胞周期失去干性,分化發(fā)展成為多種形態(tài)、不同功能的成熟的神經(jīng)細(xì)胞。大量研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞生命活動過程中,大部分蛋白質(zhì)只有經(jīng)過翻譯后的修飾加工才能具有生物活性,從而參與細(xì)胞內(nèi)的各種生命活動。棕櫚酰化加工修飾作用,是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后最重要的修飾加工方式的一種。目前的研究中,一些關(guān)于棕櫚酰化的蛋白質(zhì)組學(xué)、關(guān)于具有棕櫚酰化轉(zhuǎn)移酶功能的DHHC家族的研究結(jié)果,暗示細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的棕櫚�；揎椉庸に�,在各時期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中和相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中,可能有著重要的調(diào)控作用。因而,明確細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯后的棕櫚�；揎椉庸�,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程(神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷)以及成體神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中的作用,及其內(nèi)在分子水平的調(diào)控機(jī)制,已經(jīng)成為近年來神經(jīng)生物科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。本研究中,我們通過體外培養(yǎng)的小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞模型,利用棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑—2-溴棕櫚酸(2-bromopalmitate),來探討細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯后的棕櫚�；揎椉庸ぷ饔迷谂咛グl(fā)育時期神經(jīng)干細(xì)胞中的功能作用及有關(guān)的內(nèi)部分子機(jī)制。第一部分2-溴棕櫚酸對小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響關(guān)于棕櫚�；南嚓P(guān)研究中證實,高濃度的2-溴棕櫚酸會產(chǎn)生細(xì)胞毒性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而低濃度對細(xì)胞活力沒有明顯的影響,本研究中實驗組均采用低濃度的2-溴棕櫚酸:10 μM。關(guān)于棕櫚�；绊懮窠�(jīng)干細(xì)胞NSCs增殖方面的研究,首先在增殖培養(yǎng)條件下,利用倒置相差顯微鏡,觀察小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的大體形態(tài)有無變化,結(jié)果顯示,2-溴棕櫚酸處理組中神經(jīng)球(神經(jīng)干細(xì)胞自然增殖形成的球狀結(jié)構(gòu))的形態(tài)和致密度等,與對照組相比,均沒有明顯的改變;用MTT實驗的方法檢測小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞活度,結(jié)果顯示:增殖培養(yǎng)1天、2天、3天和5天,處理組中神經(jīng)干細(xì)胞的活力,與對照組相比,沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差別;采取神經(jīng)干細(xì)胞NSCs貼壁培養(yǎng)的模式,利用蛋白免疫熒光染色的實驗技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),2-溴棕櫚酸處理組中,神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物蛋白Nestin,以及干性維持標(biāo)記物蛋白Sox2的表達(dá),與對照組相比,沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差別;與此同時,利用Western blot的實驗技術(shù)對小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白Nestin和Sox2的表達(dá)量進(jìn)行檢測,結(jié)果與免疫熒光實驗結(jié)果是非常一致的,處理組中Nestin蛋白和Sox2蛋白的表達(dá)量與對照組比較,沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。以上實驗結(jié)果表明,2-溴棕櫚酸對小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,沒有產(chǎn)生明顯的影響。為了探究蛋白質(zhì)翻譯后的棕櫚�；揎椉庸ぷ饔迷谏窠�(jīng)干細(xì)胞NSCs進(jìn)入分化階段后的有關(guān)影響,首先采用免疫熒光染色技術(shù),以檢測與神經(jīng)干細(xì)胞分化成熟為成熟細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物蛋白:MAP2、GFAP和NG2等的表達(dá)與分布情況。實驗結(jié)果顯示,2-溴棕櫚酸處理組中分化成熟的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù),與對照組相比,明顯減少,并且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。繼續(xù)利用Western Blot技術(shù),檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記物蛋白:MAP2、GFAP和NG2的表達(dá)水平,實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組中MAP2、GFAP和NG2等的蛋白水平均呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)。繼續(xù)利用qRT-PCR技術(shù),檢測相關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞分化命運(yùn)決定因子水平,來印證2-溴棕櫚酸對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組中分化命運(yùn)決定因子NeuroDl、GFAP、0lig2等mRNA的表達(dá)受到明顯抑制。既然,NSCs的細(xì)胞分化是與分化命運(yùn)決定相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子息息相關(guān),由此可以同時借助多種實驗技術(shù)對NSCs相關(guān)的因子進(jìn)行檢測。通過免疫熒光染色技術(shù),與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白Nestin和干性維持標(biāo)記物蛋白Sox2獲得持續(xù)性的高表達(dá),同時,qRT-PCR結(jié)果顯示,與增殖相關(guān)的多潛能因子Sox2、Nestin mRNA亦獲得持續(xù)性的高表達(dá)。這些結(jié)果提示,在分化培養(yǎng)條件下,小分子化合物2-溴棕櫚酸,通過抑制與神經(jīng)干細(xì)胞分化命運(yùn)決定相關(guān)因子的表達(dá),促進(jìn)自我更新增殖相關(guān)因子的表達(dá),從而抑制了小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化命運(yùn)的發(fā)生。第二部分2-溴棕櫚酸影響小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化命運(yùn)轉(zhuǎn)換的機(jī)制研究為了揭示2-溴棕櫚酸影響小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化的內(nèi)在的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,首先利用TUNEL染色技術(shù)檢測2-溴棕櫚酸是否通過促進(jìn)分化期神經(jīng)干細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致分化相關(guān)因子的表達(dá)減少,結(jié)果顯示,2-溴棕櫚酸處理組中小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的數(shù)量有一定的減少,但是在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著的差異。這表明2-溴棕櫚酸對分化期的神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的影響不是由促進(jìn)凋亡引起的。第一部分中免疫熒光染色技術(shù)實驗和qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組中神經(jīng)干細(xì)胞干性維持相關(guān)因子Nestin和Sox2在蛋白水平和mRNA水平均獲得持續(xù)性的高表達(dá),說明2-溴棕櫚酸是通過促進(jìn)分化期神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,從而抑制其分化的發(fā)生。接下來,通過一系列的相關(guān)技術(shù)實驗檢測,來再次印證這個結(jié)論。首先采用MTT的實驗技術(shù)檢測2-溴棕櫚酸對分化時期神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響作用,結(jié)果顯示,2-溴棕櫚酸處理組中,MTT值隨著分化天數(shù)的延長呈現(xiàn)出明顯的增長,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。同時利用BrdU摻入法印證分化期神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的改變,結(jié)果與MTT實驗變化相一致,2-溴棕櫚酸處理組中,BrdU陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯增加,具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。以上實驗結(jié)果證明,2-溴棕櫚酸導(dǎo)致小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分化命運(yùn)被抑制,增殖能力得到提高。干細(xì)胞在接受到分化信號的刺激后,首先得退出細(xì)胞周期,然后才能表達(dá)分化相關(guān)的因子,開始進(jìn)入細(xì)胞分化的狀態(tài)。既然實驗結(jié)果顯示2-溴棕櫚酸抑制了小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分化,接下來利用細(xì)胞流式技術(shù)(FACS)檢測分化階段神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)5天,經(jīng)FACS實驗技術(shù)檢測并分析,結(jié)果顯示,對照組中的神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于G0/G1期(分裂間期);而2-溴棕櫚酸處理組中,處于G0/G1期(分裂間期)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目卻顯著減少,處于S期(有絲分裂期)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目明顯增多。與此同時,采用qRT-PCR的實驗技術(shù),檢測與神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)的多種CKIs(細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子)表達(dá)情況,用來闡明2-溴棕櫚酸阻礙神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期退出的內(nèi)在相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果顯示,,2-溴棕櫚酸處理組中,與分化相關(guān)的CKIs因子P21、P27與P57的表達(dá)在分化培養(yǎng)24h時即受到明顯抑制,而細(xì)胞周期增殖標(biāo)記物Ki67一直維持在高水平表達(dá)。以上實驗結(jié)果表明,2-溴棕櫚酸可下調(diào)小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化期相關(guān)CKIs家族因子P21、P27與P57等的表達(dá)水平,從而使細(xì)胞周期的退出受阻,進(jìn)而抑制神經(jīng)分化的發(fā)生;通過上調(diào)增殖相關(guān)因子Ki67的表達(dá),從而使處于分化狀態(tài)下的小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞,自我更新增殖能力獲得明顯提高。第三部分2-溴棕櫚酸影響小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)研究由第二部分實驗得知,在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中,2-溴棕櫚酸處理組中分化相關(guān)CKIs因子的mRNA表達(dá)減少,這表明2-溴棕櫚酸是通過在轉(zhuǎn)錄水平上抑制分化相關(guān)因子的表達(dá),從而抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其干性維持。在本質(zhì)上,細(xì)胞內(nèi)基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的強(qiáng)弱,與其染色質(zhì)的開放程度有密切關(guān)聯(lián),即DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)與組蛋白結(jié)合的緊密程度有關(guān)。因此,首先利用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM,用于觀察細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)),觀察細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的形態(tài)變化,結(jié)果顯示,對照組中神經(jīng)干細(xì)胞的核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為松散,為處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)的常染色質(zhì)形態(tài),而2-溴棕櫚酸組中染色質(zhì)卷曲折疊成致密的團(tuán)塊,為處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)的異染色質(zhì)形態(tài)。利用DNase Ⅰ酶切法檢測染色質(zhì)的開放程度及其與DNA的結(jié)合能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-漠棕櫚酸處理組中與分化相關(guān)的NeuroD1、GFAP與0lg2啟動子片段完整性較好,而與增殖相關(guān)的Sox2啟動子片段與對照組沒有顯著差異。暗示2-溴棕櫚酸抑制分化過程中染色質(zhì)的重塑過程與分化相關(guān)基因(NeuroDl、GFAP與Olg2)的轉(zhuǎn)錄激活。目前研究發(fā)現(xiàn),染色質(zhì)的開放程度與組蛋白的翻譯后修飾加工水平有關(guān),主要涉及組蛋白的甲基化和乙�；潭取＠肳estern Blot技術(shù)對分化期小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi),組蛋白H3的甲基化和乙�；酵瑫r進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組神經(jīng)干細(xì)胞中組蛋白H3的甲基化水平,沒有出現(xiàn)明顯的差異;而對于組蛋白H3的乙酰化水平來說,卻出現(xiàn)了顯著下降的情形。進(jìn)一步采用免疫熒光染色的實驗技術(shù)、染色質(zhì)免疫共沉淀的實驗技術(shù)(ChIP,chromatinimmunoprecipitation)等,印證 2-溴棕櫚酸對分化階段神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3(具有HAT活性的CBP/P300修飾的下游目標(biāo)物)乙�；降挠绊懽饔谩＝Y(jié)果發(fā)現(xiàn),2-溴棕櫚酸處理組中,組蛋白H3乙�；栃缘纳窠�(jīng)干細(xì)胞數(shù)與組蛋白H3的乙酰化水平明顯降低,乙�；慕M蛋白H3與命運(yùn)決定因子NeuroD1、GFAP、0lig2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物水平亦受到明顯抑制,但是Sox2卻沒有明顯變化。已知,P300與CBP是乙酰化轉(zhuǎn)移酶的主要執(zhí)行者,并且參與調(diào)控多種多潛能干細(xì)胞的命運(yùn)決定過程。因此,首先檢測2-溴棕櫚酸對細(xì)胞內(nèi)CBP/p300蛋白表達(dá)量的影響,Western blot結(jié)果顯示,實驗組與對照組沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。把細(xì)胞裂解后,針對P300與CBP,分別使用P300與CBP乙�；贵w,利用免疫共沉淀技術(shù),檢測其HAT活性,分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,2-溴棕櫚酸處理組中P300與CBP的HAT活性均受到顯著抑制。這些結(jié)果進(jìn)一步證實2-溴棕櫚酸通過下調(diào)P300和CBP的乙�；D(zhuǎn)移酶活性從而維持小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖潛能并抑制其分化進(jìn)程。第四部分2-溴棕櫚酸影響組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶CBP/P300活性的分子機(jī)制研究2-溴棕櫚酸作為棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑,尚未發(fā)現(xiàn)其對乙�；D(zhuǎn)移酶活性的直接調(diào)控作用。因此,首先從棕櫚酰化修飾角度研究2-溴棕櫚酸對P300和CBP乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。經(jīng)CSS-Pa14.0軟件分析發(fā)現(xiàn),P300和CBP并沒有典型的棕櫚酰化修飾位點,暗示2-溴棕櫚酸可能并不是直接參與調(diào)控其功能。據(jù)相關(guān)研究已知核蛋白EID1,可以與P300/CBP結(jié)合并抑制其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,因此,轉(zhuǎn)而檢測EID1的相關(guān)指標(biāo)。Western blot結(jié)果顯示,在2-溴棕櫚酸處理組中EID1表達(dá)顯著上調(diào),并且免疫共沉淀結(jié)果亦顯示,2-溴棕櫚酸組中P300和CBP與EID1的復(fù)合物量明顯增多。轉(zhuǎn)染EIDlshRNA實驗結(jié)果挽救了 2-溴棕櫚酸介導(dǎo)的神經(jīng)分化抑制作用,分化相關(guān)因子(NeuroDl、GFAP、0lig2)表達(dá)增多。這些結(jié)果表明,2-溴棕櫚酸在神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)決定過程中通過上調(diào)EID1的蛋白水平從而降低P300和CBP乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并抑制細(xì)胞分化進(jìn)程。然而通過RT-PCR進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸處理組EID1的mRNA水平?jīng)]有增加,EID1 mRNA在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的分布也無明顯差異,暗示2-溴棕櫚酸可能是通過維持EID1蛋白穩(wěn)定從而提高其蛋白水平。為了從棕櫚�；揎椀慕嵌冉沂�2-溴棕櫚酸的作用機(jī)制,利用CSS-Pal4.0軟件分析EID1的潛在棕櫚�；揎椢稽c,發(fā)現(xiàn)EID1擁有3個較為保守的棕櫚酸化修飾位點,分別為氨基酸8、123和152位置,因此,2-溴棕櫚酸可能通過調(diào)節(jié)其棕櫚酰化修飾水平從而影響其最終蛋白水平。(1)由于核蛋白EID1第123位的棕櫚�；揎椢稽c,緊鄰其第125位的泛素化修飾位點。因此,猜測可能是由于核蛋白EID1的棕櫚�；揎椨绊懥似浞核鼗男揎椝�,從而調(diào)控了其蛋白水平的高低。采用免疫共沉淀技術(shù)檢測EID1的泛素化水平,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性EID1在神經(jīng)分化階段會發(fā)生高水平的泛素化,而體外泛素化重構(gòu)檢測發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸雖然改變了 EID1的泛素化水平,卻沒有明顯的影響EID1泛素化的發(fā)生。通過Western blot技術(shù)檢測加入蛋白酶體抑制劑MG132后神經(jīng)干細(xì)胞中EID1的表達(dá)量,結(jié)果EID1的表達(dá)量明顯增多,表明EID1的降解是通過蛋白酶體途徑實現(xiàn)的。(2)已知,作為脂質(zhì)化修飾方式之一的棕櫚�；揎�,可以在亞細(xì)胞水平(即細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器)調(diào)節(jié)底物蛋白的分布。利用免疫熒光技術(shù)檢測2-溴棕櫚酸對EID1在細(xì)胞內(nèi)分布的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組中EID1主要分布在蛋白酶體,核內(nèi)很少;而2-溴棕櫚酸處理組中,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有大量的核蛋白EID1的分布。以上結(jié)果提示,2-溴棕櫚酸抑制了EID1降解的泛素化過程,提高其蛋白水平,并提高了 EID1的核轉(zhuǎn)移分布。2-溴棕櫚酸作為已知的蛋白質(zhì)棕櫚�；种苿�,有可能是通過抑制核蛋白EID1的棕櫚酰化位點,從而影響其蛋白水平和亞細(xì)胞分布。接下來通過ABE法檢測神經(jīng)干細(xì)胞中核蛋白EID1的棕櫚酰化修飾水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸導(dǎo)致EID1的棕櫚�；斤@著降低。綜和以上實驗結(jié)果,2-溴棕櫚酸通過抑制EID1的棕櫚�；�,降低其泛素化水平,減少降解,從而提高EID1的蛋白水平并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)移分布,導(dǎo)致CBP/P300的HAT活性降低,最終抑制了神經(jīng)分化的發(fā)生。結(jié)論神經(jīng)干細(xì)胞,作為一種具有多潛能功能的干細(xì)胞,其增殖、分化、發(fā)育與成熟是現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)中的研究熱點問題之一。作為細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯后的脂質(zhì)化修飾加工方式之一,棕櫚�；�,在神經(jīng)發(fā)育過程中的作用及其內(nèi)在的分子機(jī)制尚不清楚。本實驗通過建立體外的,小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞模型,利用2-溴棕櫚酸(一種小分子化合物,作為常用的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑),來探討棕櫚�；揎椉庸ぴ谂咛ピ缙谏窠�(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用及其內(nèi)在的分子機(jī)制。經(jīng)低濃度(10 μM濃度)的2-溴棕櫚酸處理后,小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖命運(yùn)沒有發(fā)生明顯改變。但是,在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化階段,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)2-溴棕櫚酸(10μM濃度)處理后,處于分化狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞,因為細(xì)胞周期的退出受阻,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)分化的過程受到抑制,而神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況卻保持在一定的高水平狀態(tài)。進(jìn)一步的檢測結(jié)果顯示,與分化相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CKIs家族中P21、P27和P57的表達(dá)顯著降低。據(jù)已知研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)分化過程中相關(guān)的CKIs家族因子的表達(dá),取決于細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3和H4翻譯后的乙酰化修飾加工水平。經(jīng)過一系列關(guān)于組蛋白H3的乙�；瘷z測實驗、關(guān)于具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性CBP/p300的檢測實驗、關(guān)于可與CBP/p300結(jié)合并抑制其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的核蛋白EID1檢測實驗,結(jié)果顯示,2-溴棕櫚酸可能是通過抑制神經(jīng)干細(xì)胞核蛋白EID1的降解,從而提高其蛋白水平,高水平的EID1通過與CBP/p300結(jié)合進(jìn)而抑制了CBP/p300的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。最終,研究表明,在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化階段,2-溴棕櫚酸處理后,由于核蛋白EID1降解的減少,從而抑制細(xì)胞內(nèi)CBP/p300的HAT(乙酰轉(zhuǎn)移酶)活性,降低了組蛋白H3的乙酰化修飾水平,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi),與分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄水平降低,CKIs家族因子表達(dá)減少,細(xì)胞周期的退出受到抑制,致使神經(jīng)分化命運(yùn)決定因子的表達(dá)減少,而增殖相關(guān)命運(yùn)決定因子表達(dá)增多,從而抑制了小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分化,提高其自我更新能力。這項研究證實了 2-溴棕櫚酸(一種小分子化合物)在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化命運(yùn)轉(zhuǎn)換過程中的作用,并深入揭示了其調(diào)控CBP/P300乙�；D(zhuǎn)移酶活性的分子機(jī)制。從組蛋白翻譯后修飾加工的角度,認(rèn)識小分子化合物2-溴棕櫚酸對胚胎神經(jīng)干細(xì)胞自我更新及分化命運(yùn)決定的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。建立了多潛能因子、命運(yùn)決定因子、表觀遺傳因子及蛋白修飾等在NSCs分化命運(yùn)轉(zhuǎn)換階段的相互作用網(wǎng)絡(luò)。本研究為認(rèn)識和研究NSCs的命運(yùn)調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)研究提供了新的線索,加深了對NSCs發(fā)育信號分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。并使得未來通過使用多種小分子化合物,來改變體內(nèi)、體外細(xì)胞的命運(yùn),并且重塑所需細(xì)胞的功能成為可能,為多種疾病的治療提供幫助。創(chuàng)新性:1、本課題首次發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)分化。2、首次發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸通過抑制EID1的棕櫚酰化,降低其泛素化水平并減少蛋白降解,從而提高EID1的蛋白水平并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)移分布,EID1表達(dá)升高導(dǎo)致CBP/P300的HAT活性降低,最終抑制了神經(jīng)干細(xì)胞分化的發(fā)生。3.首次發(fā)現(xiàn)2-溴棕櫚酸調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化的直接作用靶點——EID1,為將來使用小分子化合物重塑細(xì)胞功能成為可能。示意圖如下:圖1:2-溴棕櫚酸通過抑制EID1的棕櫚�；�,降低其泛素化水平并減少蛋白降解,從而提高EID1的蛋白水平并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)移分布,a.EID1表達(dá)升高致使CBP/P300的HAT活性降低,最終抑制了神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)分化的發(fā)生;b.正常情況下,EID1蛋白若被降解則對CBP/P300的HAT活性無影響,神經(jīng)干細(xì)胞將進(jìn)行正常分化過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338
【圖文】：

圖１－１增殖培養(yǎng)條件下２－溴棕櫚酸對小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的影響作用。Ａ倒逡逑置相差顯微鏡下神經(jīng)球的變化，與對照組相比，２－溴棕櫚酸組中神經(jīng)球的大體逡逑形態(tài)和致密度改變不明顯。標(biāo)尺，２００咖。Ｂ邋ＭＴＴ實驗技術(shù)檢測增殖培養(yǎng)１天、逡逑２天、３天、５天的神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞活性變化，實驗組與對照組的細(xì)胞活力，逡逑在統(tǒng)計學(xué)上差異不明顯。ＣＮＳＣｓ免疫熒光染色結(jié)果顯示，２－溴棕櫚酸組中ＮＳＣｓ逡逑標(biāo)記物Ｎｅｓｔｉｎ和千細(xì)胞特性維持標(biāo)記物Ｓ0Ｘ２的表達(dá)與對照組沒有明顯的統(tǒng)計逡逑學(xué)差異。標(biāo)尺，２０ｒｔｎ。Ｄ細(xì)胞增殖培養(yǎng)３天后，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗技術(shù)檢逡逑測神經(jīng)干細(xì)胞中干性標(biāo)記物Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２的蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，逡逑與對照組相比，２－溴棕櫚酸組Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２的蛋白表達(dá)量均沒有明顯的統(tǒng)計逡逑學(xué)差異。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋２ＢＲ０邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＮＳＣｓ．邋（Ａ）逡逑

Ｈ｜＾ＳｆＫ３Ｈ＾邋Ｓｏｘ２｜—？＾—Ｐ逡逑ＰＨ＾ＢｊＢｊｊ＾ＨＫ邋（Ｂ－ａｃｔｉｎ邋ＷＷ＜逡逑圖１－１增殖培養(yǎng)條件下２－溴棕櫚酸對小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的影響作用。Ａ倒逡逑置相差顯微鏡下神經(jīng)球的變化，與對照組相比，２－溴棕櫚酸組中神經(jīng)球的大體逡逑形態(tài)和致密度改變不明顯。標(biāo)尺，２００咖。Ｂ邋ＭＴＴ實驗技術(shù)檢測增殖培養(yǎng)１天、逡逑２天、３天、５天的神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞活性變化，實驗組與對照組的細(xì)胞活力，逡逑在統(tǒng)計學(xué)上差異不明顯。ＣＮＳＣｓ免疫熒光染色結(jié)果顯示，２－溴棕櫚酸組中ＮＳＣｓ逡逑標(biāo)記物Ｎｅｓｔｉｎ和千細(xì)胞特性維持標(biāo)記物Ｓ0Ｘ２的表達(dá)與對照組沒有明顯的統(tǒng)計逡逑學(xué)差異。標(biāo)尺，２０ｒｔｎ。Ｄ細(xì)胞增殖培養(yǎng)３天后，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗技術(shù)檢逡逑測神經(jīng)干細(xì)胞中干性標(biāo)記物Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２的蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，逡逑與對照組相比，２－溴棕櫚酸組Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２的蛋白表達(dá)量均沒有明顯的統(tǒng)計逡逑學(xué)差異。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋２ＢＲ０邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａ

廣Ｒ0逡逑■邋＾邋Ｉ邋１邋“逡逑ｍＲＳＨＨ邋ｉ３°－邋■邐ｈｈ逡逑■邐｜ｏ邐｜逡逑■■丨ｎＪ逡逑圖１－２小鼠神經(jīng)千細(xì)胞分化條件下培養(yǎng)３天、５天、７天，免疫熒光染色逡逑結(jié)果：Ａ與對照組相比，２－溴棕櫚酸組中神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)元、星逡逑型膠紙細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，在數(shù)量均明顯減少。Ｂ與對照組相比，２－溴棕櫚逡逑酸組中神經(jīng)干細(xì)胞特有標(biāo)記物Ｎｅｓｔ邋ｉｎ和干細(xì)胞特性維持標(biāo)記物Ｓｏｘ２均呈現(xiàn)出逡逑持續(xù)性的高水平表達(dá)。標(biāo)尺：５０邋ｙｍ。柱狀圖為陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果分析，逡逑＊ｐ＜０．邋０５，＊＊ｐ＜０．０１，ｎｓ沒有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑４９逡逑

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本文編號：2793003