【摘要】：結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染引起的慢性呼吸道傳染病,世界上三分之一的人口已被感染,每年新發(fā)病例接近九百萬例,它在世界范圍內(nèi)傳播、發(fā)病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占據(jù)結核分枝桿菌基因組編碼區(qū)的10%,PE/PPE蛋白家族中一些成員被鑒定為是毒力因子,參與宿主免疫反應,但大部分PE/PPE蛋白的確切功能還需要探索,其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核體系表達和純化獲得的PPE25、PPE27、PE19蛋白與小鼠巨噬細胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外,為以后更深入地研究該家族蛋白的功能和在機體免疫調(diào)節(jié)中的作用,成功構建了帶有FLAG標簽的重組穿梭表達載體pMV261-ppe25,并電轉化至無毒快速生長的恥垢分枝桿菌,從而獲得重組菌株。1.結核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對巨噬細胞RAW264.7細胞因子和死亡方式的影響純化獲得重組蛋白PPE25.PPE27和PE19,去除內(nèi)毒素后經(jīng)過鱟試劑測定內(nèi)毒素含量,BCA法測定蛋白濃度。按照濃度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分別刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7,作用24 h后,用Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric)試劑盒檢測細胞活性,發(fā)現(xiàn)PPE25、PPE27和PE19對RAW264.7的活性有顯著的抑制作用(p0.05),且呈現(xiàn)劑量依賴性。重組蛋白以不同濃度作用于巨噬細胞RAW264.7,作用24和48 h采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測細胞死亡方式。結果顯示,PPE25、PPE27和PE19都導致RAW264.7發(fā)生細胞壞死,說明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同時,應用液體懸浮芯片系統(tǒng)luminex200方法檢測不同濃度的重組蛋白PPE25、PPE27和PE19與RAW264.7相互作用后培養(yǎng)上清中細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表達量的變化,從而評價PPE25、PPE27和PE19對RAW264.7炎性反應的影響。重組蛋白PPE25、PPE27和PE19分別以1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL的濃度刺激RAW264.7,作用24和48h后,與空白組相比,重組蛋白PPE25引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量有所上升。重組蛋白PE19引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量沒有明顯差異。然而重組蛋白PPE27引起IL-6分泌量顯著下調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量也下調(diào)。此外,重組蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬細胞IL-1β表達量均低于檢測線2.13 pg/mL,IL-12p40表達量均低于檢測線2.09 pg/mL。這些差異表達證實重組蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通過調(diào)控促炎性因子IL-6的表達引起巨噬細胞免疫應答。2.表達結核分枝桿菌ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構建以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,采用PCR技術擴增ppe25基因序列并添加FLAG標簽,以便Western-blot檢測其表達。將PCR產(chǎn)物定向克隆到克隆載體pCR2.1,測序結果與GenBank公布的基因序列完全一致。經(jīng)BamH I/EcoR I雙酶切獲得ppe25酶切片段,克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261,通過酶切及PCR鑒定正確后,將重組質(zhì)粒pMV261-ppe25電轉化恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài),構建、篩選重組恥垢分枝桿菌,命名為rMS-pMV261-ppe25。重組恥垢分枝桿菌的PCR和酶切鑒定表明構建正確。重組菌經(jīng)45℃30min誘導表達,超聲裂解后的Western-blot結果表明,目的蛋白與抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG標簽單克隆抗體發(fā)生特異性的反應,與預期條帶大小39.51kD一致。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911
【圖文】：

ＰＡＭＰｓ，其中包括脂甘聚糖（ＬＭ）、脂阿拉伯糖甘聚糖（ＬＡＭ）、脂蛋白Ｌｐ巧、ＬｐｒＧ、逡逑ＬｐｒＡ、ＭＰＴ８３、１１８９６０和￡８冷１＇－妒２－１７１。研究表明很多了８相關的蛋白傾向于與化１１２相互逡逑作用。如圖２所示，ＴＬＲ２不僅能獨自發(fā)揮作用，也可Ｗ與其他表面受體包括共同受體和逡逑輔助受體結合X椙顆涮宓氖侗鷙痛蕁；纈耄裕蹋遙被潁裕蹋遙緞饔謾⒏ㄖ芴澹茫模保村義現(xiàn)鋁τ冢蹋穡瘢取ⅲ蹋穡潁嗆停蹋穡潁潦侗�、而辅助受体ＣＤ３嶄Xτ詡觳猓蹋穡潁粒蕖＠醋圓煌岷隋義細塑繅鷸值模蹋投寄芤鵓奩叵赴せ�。}停校裕福襯芤穡裕危疲帷⒈齲逗駝保玻穡矗板逕�，辶x喜⑶夷萇系鰨桑疲危盞嫉模停齲茫畋澩錚虼薠椙苛隋澹潁停校裕福扯嚳糲潁茫模矗韻赴某實蕁ｅ義希潁停校裕福場ⅲ桑疲危倩蛘擼潁停校裕福秤耄桑疲危峰濉鴯婕ぞ捺拖赴蠖寄萇系鰨危戲置謁健Ｗ艿膩義俠此擔潁停校裕福匙魑裕蹋遙布せ羆聊艿鶻諳赴蜃擁姆置諍吞岣呔轛S細胞的功能。除此Ｗ外，逡逑ＴＬＲ２調(diào)節(jié)的信號通路能引起很大范圍宿主免疫反應用于清除ＭＴＢ，總結如圖ｌｔｉ８ｌｓＥＳＡＴ－６逡逑通過ＴＬＲ２依賴途徑瓦解宿主免疫反應，ＭＴＢ的ＥＳＡＴ６與ＴＬＲ２胞外直接相互作用挪制逡逑巨睡細胞的ＴＬＲ信號通路。很多ＭＴＢ的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白能與ＴＬＲ２直接相互作用，但是不逡逑同的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白激發(fā)不同的ＴＬＲ２下游信號級聯(lián)放大。ＰＰＥ３４ｔＷ激發(fā)ＴＬＲ２－Ｐ３８邋ＭＡＩ＞Ｋ信逡逑號通路并產(chǎn)生正－１０

Ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋掠準品粉末溶于邋２５０邋ｎＬ邋ＳＷ邋后濃度是邋１００００邋ｐｇ／ｍＬ，按照梯逡逑度稀釋后，依次稀釋成２０００、４００、８０、１６、３．２邋ｐｇ／ｍＬ，系統(tǒng)檢測自動生成際準曲線。如逡逑圖１－５所示，各細胞因子的相關系數(shù)Ｒ２在０．９７￣１．００之間，從而保證檢測樣品的準確性。逡逑ＩＬ－６逡逑W'－ＩＰ逡逑拉，４２８％，Ｒ？，０燃邐＊０．９３４逡逑巧３－邐／邐巧４－逡逑．－Ｉ邐Ｌ邐邐Ｌ邐．逡逑巧－，邐如邐如邐巧Ｓ邐巧１日１邐１0３邐巧５逡逑柳，＇邐ｐｇ／ｍｌ逡逑W'－１２ｐ４０邐ＴＮＦ－ａ逡逑議＊３欲，巧？０．~s邐ＣＶ，１７i輳螅ⅲ希憂懾義希保板澹吻桑渭滓誨義锨芍粒吻桑玻義�！儒帲＊�

本文編號：2789747