【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)一種重要的多功能的細胞器之一,參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和折疊,Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持以及脂質(zhì)的生物合成。許多生理性和病理性應激因素可以誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生,如缺血、缺氧、氧化低密度脂蛋白、血管緊張素Ⅱ,腫瘤壞死因子α和脂質(zhì)代謝狀態(tài)的改變等。這些應激因素能夠減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能和干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)功能,導致未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷積聚,從而引發(fā)未折疊蛋白反應,也就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。嚴重或者長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激不但損傷細胞的正常生理功能,還導致細胞的凋亡,參與各種疾病的病理生理過程。近年來,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激越來越受到心血管領域研究的重視,研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了心腦缺血/再灌損傷、動脈粥樣硬化、心肌肥厚和心力衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。因此,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被認為是病理性細胞功能障礙和死亡的主要觸發(fā)者,與心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān),提示其可能成為心血管疾病的一個重要的干預靶點。 乙醛脫氫酶2(Aldehyde Dehydrogenase-2, ALDH2)是一種四聚體酶,主要表達于肝臟、肺臟以及一些高效產(chǎn)能器官,如心臟和腦。已知其主要作用是醛類物質(zhì)的解毒作用,包括4-羥基壬烯酸(4-HNE)、乙醛、丙烯醛和短鏈芳烴或多環(huán)芳烴等。作為線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶,近年來研究發(fā)現(xiàn)ALDH2通過代謝毒性醛類物質(zhì)減小缺血引發(fā)的心肌損傷,激活ALDH2能夠使缺血/再灌所致心肌梗死面積減少60%。此外,越來越多的證據(jù)表明ALDH2能夠減輕乙醇、乙醛、4-HNE等活性醛類帶來的細胞損傷及其誘導的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。因此,目前ALDH2被認為是一種重要的內(nèi)源性保護因子,在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 本研究通過ALDH2基因敲除小鼠和構(gòu)建衣霉素(Tunicamycin)誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激動物模型,研究ALDH2對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其誘導的心功能不全的作用,進一步闡述ALDH2對心血管疾病保護性作用的機制。 第一部分：ALDH2基因敲除對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導心功能不全的影響 目的：采用ALDH2敲除小鼠模型探討ALDH2對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其誘導的心功能不全的作用 方法：采用C57野生型小鼠和ALDH2敲除小鼠作為動物來源,腹腔內(nèi)注射衣霉素(3mg/kg),48h后小動物心超評估心臟功能,Western blot檢測Grp78、p-eIF2α、 CHOP的表達,TUNEL法檢測心臟組織中的細胞凋亡情況。 結(jié)果：采用衣霉素腹腔注射小鼠,48h后采用小動物心超評估心臟功能,發(fā)現(xiàn)衣霉素能夠顯著誘導野生型小鼠心臟功能不全。與野生型小鼠相比,ALDH2基因敲除小鼠在衣霉素注射后心功能不全顯著惡化,表現(xiàn)為射血分數(shù)(EF)和縮短分數(shù)(FS)減低,左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)增高,而左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)無顯著性差異。心臟組織Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)衣霉素顯著增加野生型小鼠心臟Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平；與野生型小鼠衣霉素處理組相比,ALDH2敲除小鼠在衣霉素處理后,Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平顯著增加。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在衣霉素處理后,心肌組織中的凋亡細胞顯著增加；與野生型小鼠衣霉素處理組相比,ALDH2基因敲除小鼠處理后心肌組織中凋亡細胞顯著增加。 結(jié)論：ALDH2基因敲除能夠使衣霉素誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物蛋白水平及凋亡顯著增加,可能介導了心功能不全進一步惡化。 第二部分：ALDH2對心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡的作用 目的：體外實驗進一步研究ALDH2對心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其誘導的凋亡的作用。 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù),通過衣霉素(5μg/ml)干預心肌細胞12h,Western blot檢測Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平,MTT法檢測衣霉素誘導的細胞毒性作用,Caspase-3活性檢測評估衣霉素對細胞的促凋亡作用。 結(jié)果：采用Gateway技術(shù),成功構(gòu)建的ALDH2腺病毒,RT-PCR和測序證實腺病毒載體中ALDH2的序列,熒光顯微鏡證實病毒轉(zhuǎn)染成功,Western Blot證實ALDH2腺病毒感染后的心肌細胞ALDH2蛋白水平顯著增高,ALDH2siRNA能夠顯著抑制ALDH2的表達。Western Blot證實衣霉素能顯著上調(diào)的Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA干擾分別抑制和加劇了這一效應。MTT檢測發(fā)現(xiàn)衣霉素顯著誘導心肌細胞毒性作用,Caspase-3活性分析發(fā)現(xiàn)衣霉素顯著增加心肌細胞的Caspase-3活性,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA干擾分別抑制和加劇了衣霉素誘導的細胞毒性和凋亡。 結(jié)論：體外實驗證實ALDH2能夠顯著抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡,提示ALDH2在心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中發(fā)揮著重要的保護性作用。 第三部分：ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡的機制研究 目的：研究ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡的潛在機制 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù),衣霉素干預心肌細胞后,Westernblot檢測p-Akt、Akt和p47phox NADPH氧化酶蛋白水平。采用LY294002抑制PI3-K,Western blot檢測衣霉素干預心肌細胞后Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平的變化,MTT法檢測衣霉素誘導的細胞毒性作用,Caspase-3活性分析評估衣霉素對細胞的促凋亡作用。 結(jié)果：衣霉素顯著抑制p-Akt的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA分別逆轉(zhuǎn)Akt的磷酸化水平和進一步抑制了Akt的磷酸化水平。同時,衣霉素顯著上調(diào)了p47phox亞單位的蛋白水平,而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA分別能夠顯著抑制和進一步加劇衣霉素上調(diào)的p47phox亞單位蛋白水平。NAC處理也能有效的阻斷衣霉素上調(diào)p47phox亞單位蛋白水平。LY294002抑制PI3-K后,ALDH2抑制的Grp78、p-eIF2a和CHOP的蛋白水平無明顯變化,然而LY294002能夠顯著阻斷ALDH2抑制衣霉素上調(diào)p47phox亞單位蛋白水平的作用。此外,LY294002能夠顯著ALDH2抑制衣霉素上調(diào)Caspase-3活性的作用。 結(jié)論：ALDH2抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導凋亡的保護性作用可能是通過PI3-K-Akt-p47phox通路所介導。 第四部分：4-HNE在ALDH2調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用 目的：闡明4-HNE在ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其誘導的凋亡的作用 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù),通過衣霉素干預心肌細胞,Western Blot檢測4-HNE adducts蛋白水平。采用4-HNE干預心肌細胞,WesternBlot檢測Grp78和p-Akt蛋白水平。 結(jié)果：Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)衣霉素能夠顯著增加心肌細胞4-HNE修飾蛋白水平,而4-HNE能夠顯著抑制Akt活性,增加Grp78蛋白水平。 結(jié)論：衣霉素誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的同時增加心肌細胞4-HNE,后者能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和抑制Akt,提示ALDH2能夠通過發(fā)揮其清道夫作用調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的凋亡作用。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2778748