發(fā)布時間：2020-08-02 09:35

【摘要】：目的:1.觀察生理狀態(tài)下骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的過表達對造血的影響。2.5-氟尿嘧啶誘導的骨髓抑制或應激造血條件下BMP4對造血干/祖細胞的周期、凋亡的調(diào)控以及相關機制的初步探討。3.研究BMP4蛋白的過表達對Lineage~-c-kit~+Sca-1~+造血干細胞移植后的歸巢效率和造血重建能力的影響。方法:1.BMP4過表達的C57BL/6品系轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建和繁育。2.血常規(guī)儀器檢測轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血各參數(shù),通過流式細胞儀和特異性抗體標記各譜系造血祖細胞觀察骨髓中各血系細胞的比例。3.熒光定量PCR檢測骨髓基質(zhì)中的造血調(diào)控因子Csf2、Csf3、CXCL12、SCF、ANG-1、Hif-1α的mRNA表達情況。4.Western-blot法檢測骨髓基質(zhì)中整合素α4蛋白的表達水平。5.5-FU以150mg/kg的劑量誘導骨髓抑制模型,提取骨髓有核細胞。6.動態(tài)觀察骨髓抑制后的外周血細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù),7.通過c-kit/Sca-1熒光抗體雙標HSPC,分別用Annexin V/PI和Ki-67/DAPI雙染法觀察其凋亡和細胞周期的變化。8.流式分選技術分選出造血干細胞,通過靜脈注射移植入接受致死性劑量輻照的小鼠體內(nèi),16小時后觀察經(jīng)過CFSE示蹤的造血干細胞的歸巢效率。通過觀察組間小鼠的生存期,判斷所移植造血干細胞的重建能力。結(jié)果:1.相對于野生型組,生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)基因小鼠外周血粒細胞數(shù)明顯增高(P0.01)。2.轉(zhuǎn)基因組骨髓基質(zhì)中Csf3和整合素α4的mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)(P0.05)。3.5-FU骨髓抑制后外周血細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)在第4天達到最低點。4.生理狀態(tài)下,野生型組和轉(zhuǎn)基因組造血干/祖細胞周期和凋亡率無明顯差異。骨髓抑制第4天,轉(zhuǎn)基因組骨髓中造血干/祖細胞的G_0期比例明顯降低(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.05)。5.轉(zhuǎn)基因組骨髓基質(zhì)中維持造血干/祖細胞靜息的低氧誘導因子HIF-1α和趨化因子CXCL12明顯下調(diào)(P0.01)。6.致死性輻照后,轉(zhuǎn)基因組造血干細胞的移植效率和移植后小鼠生存期均明顯低于野生型組(P0.01)。結(jié)論:1.生理狀態(tài)下,BMP4的過表達可以促進粒系增生。同時可能是通過Csf3發(fā)揮此功能。2.骨髓抑制或造血應激條件下,BMP4的過表達降低了CXCL12和Hif-1α的mRNA表達水平,促進造血干細胞進入細胞周期,同時增加造血干細胞的凋亡率。3.造血微環(huán)境中BMP4過表達削弱了HSC的歸巢效率和長期重建能力。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

、小鼠外周血血象的檢測提取小鼠的外周血，觀察紅細胞，白細胞等參數(shù)，并對各類白細胞的成分例進行了檢測，結(jié)果表明，在生理情況下，BMP4 的過表達沒有對外周血產(chǎn)生顯的影響。A：基因編輯簡圖 B：PCR 篩選結(jié)果圖 1 BMP4 鼠的構(gòu)建與篩選Fig.1 Establishment and screening of the transgenic mice

、小鼠外周血血象的檢測提取小鼠的外周血，觀察紅細胞，白細胞等參數(shù)，并對各類白細胞的成分例進行了檢測，結(jié)果表明，在生理情況下，BMP4 的過表達沒有對外周血產(chǎn)生顯的影響。A：基因編輯簡圖 B：PCR 篩選結(jié)果圖 1 BMP4 鼠的構(gòu)建與篩選Fig.1 Establishment and screening of the transgenic mice

三、5-FU 骨髓抑制后的血象及骨髓有核細胞數(shù)變化組間無明顯差異5-FU 以 150mg/kg 的劑量對小鼠進行骨髓抑制，并觀察 0 至 8 天中外周血白細胞（WBC）和骨髓有核細胞（BMNC）數(shù)量的動態(tài)變化。如圖 2 所示，野生型和轉(zhuǎn)基因鼠的造血系統(tǒng)同時在第 4 天受到最大程度的破壞，并且損傷程度無顯著差異。

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