【摘要】：1.目的:通過研究間充質干細胞(MSC)在不同共培養(yǎng)模式下對造血干細胞(HSC)體外增殖的影響,并探究其機制,從而盡可能真實地模擬體內HSC增殖的骨髓微環(huán)境,尋找更好的促進HSC體外增殖的方法。方法:1.C57小鼠MSC分離、培養(yǎng):采用全骨髓培養(yǎng)法,將C57BL/6小鼠骨髓細胞,在胎牛血清含量為10%、青-鏈霉素含量為1%、DMEM-F12含量為89%的培養(yǎng)基中培養(yǎng),第一個48h行半量換液,此后每隔2天行全量換液一次,于倒置相差顯微鏡下動態(tài)對細胞的形態(tài)變化及生長情況進行觀察。至培養(yǎng)瓶底面的細胞長至約90%融合時,按1:2比例傳代。連續(xù)觀察P0、P1、P2、P3代MSC生長情況、形態(tài)變化。2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定:通過密度梯度離心,獲得稀釋液層下的小鼠骨髓單個核細胞(MNC),MACS-CD117+磁珠分選HSC。應用流式細胞計數(shù)儀(FACS)檢測CD117陽性細胞的純度。3.間充質干細胞促進造血干細胞增殖的研究:設置對照組:HSC組(24孔板內單獨接種造血干細胞)、MSC組(24孔板內單獨接種間充質干細胞);實驗組:Transwell共培養(yǎng)組(24孔板對應規(guī)格Transwell內單獨接種造血干細于上室、間充質干細胞于下室)、2D接觸共培養(yǎng)組(24孔板共同接種造血干細胞與間充質干細胞)。體外培養(yǎng)7天,觀察HSC生長情況、形態(tài)變化、進行細胞計數(shù)、并繪制生長曲線、Cell Counting Kit(CCK-8)法測定HSC擴增情況。測定各個組MSC細胞數(shù)量,ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中SDF-1及VFGF的表達情況。結果:1.C57BL/6小鼠的MSC的分離培養(yǎng):倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)5天開始出現(xiàn)梭形貼壁細胞,約第12天梭形細胞融合度可達90%-95%。傳代后細胞貼壁生長較快,多在24 h內貼壁。傳至第3代后6-7天可生長達80%融合并呈長梭形密集排列。間充質干細胞經(jīng)傳代后的細胞純度逐漸升高。2.GFP小鼠的HSC的分離鑒定:實驗中平均每只GFP小鼠的骨髓細胞液經(jīng)密度梯度離心后可以獲得約5.5×107個單個核細胞,經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)活性細胞率為97%。MNC經(jīng)MACS CD117磁珠分選后,平均可以獲得約1.3×105個CD117+細胞,活細胞率為98%。骨髓MNC中CD117+細胞含量約0.24%。熒光顯微鏡下可見HSC呈圓形,并可激發(fā)出綠色熒光,大小均一。流式鑒定結果顯示,磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51%。3.不同培養(yǎng)模式下間充質干細胞對造血干細胞增殖的影響:(1)鏡下觀察MSC對HSC增殖的影響:熒光顯微鏡觀察顯示:各組HSC細胞數(shù)量隨著共培養(yǎng)時間的延長而增多,且2D共培養(yǎng)組熒光細胞數(shù)量較其他組明顯增多;(2)計數(shù)法檢測MSC對HSC增殖的影響:對細胞計數(shù)進行分析:共培養(yǎng)第1天,3組HSC活性細胞數(shù)量與接種時(d0)比較,HSC組(control group,單獨培養(yǎng)HSC組)與接種時比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.151);Transwell共培養(yǎng)組與接種時比較,P=0.010;2D共培養(yǎng)組與接種時比較,P=0.002。共培養(yǎng)第1天比較3組中HSC數(shù)量,HSC單獨培養(yǎng)組與Transwell組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.718);2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.0000。共培養(yǎng)第3天,3組間HSC細胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.004;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.002;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.010。共培養(yǎng)第5天,3組間HSC細胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.039;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.000。共培養(yǎng)第7天,3組間HSC細胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.000。(3)CCK-8法檢測HSC增殖:對1、3、5、7天HSC樣本進行CCK-8檢測OD值,從生長曲線可以看出,隨培養(yǎng)時間的延長各組HSC數(shù)量均隨之增加,第3天開始HSC細胞進入對數(shù)生長期,與MSC共培養(yǎng)對HSC增殖有促進作用,2D共培養(yǎng)模式較Transwell共培養(yǎng)的促進作用更明顯。共培養(yǎng)第一天,HSC單獨培養(yǎng)組與Transwell共培養(yǎng)組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.151);HSC單獨培養(yǎng)組與2D共培養(yǎng)組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.054)。共培養(yǎng)3-7天,共培養(yǎng)組細胞增殖明顯高于HSC單獨培養(yǎng)組,P0.05;且2D共培養(yǎng)組明顯高于Transwell共培養(yǎng)組,P0.05。4.不同培養(yǎng)模式下,間充質干細胞促進造血干細胞增殖可能的機制:(1)培養(yǎng)第7天,采用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)液中SDF-1含量,結果顯示:2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于MSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于MSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.017。(2)培養(yǎng)第7天,采用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)液中VEGF含量,結果顯示:2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.0000;Transwell組高于HSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于MSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于MSC單獨培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.009。(3)計數(shù)法檢測共培1、3、5、7天各組MSC數(shù)量,結果顯示:MSC細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長而增加,自第3天進入對數(shù)生長期,2D和Transwell共培養(yǎng)組的MSC數(shù)量均高于MSC單獨培養(yǎng)組,2D共培養(yǎng)組細胞數(shù)量高于Transwell共培養(yǎng)組,以第7天最為明顯。(4)對第7天HSC細胞數(shù)量、MSC細胞數(shù)量、SDF-1含量、VEGF含量進行相關性分析,結果顯示:SDF-1、VEGF與HSC、MSC細胞數(shù)量間呈明顯正相關(P0.05)。結論:1.與間充質細胞進行共培養(yǎng)的造血干細胞的增殖能力強于單獨培養(yǎng)的造血干細胞,且2D接觸共培養(yǎng)的模式對造血干細胞增殖的促進作用優(yōu)于非接觸共培養(yǎng)模式。2.2D接觸共培養(yǎng)模式促進造血干細胞增殖作用更強的機制可能有以下幾點:(1)MSC與HSC在2D接觸共培養(yǎng)模式下,分泌了更多的血管生成因子(VEGF)和趨化因子(SDF-1)。(2)SDF-1和VEGF的分泌具有相關性,共同促進了HSC和MSC的增殖。(3)HSC對MSC增殖的具有促進作用,MSC的增殖能力在接觸共培養(yǎng)模式下較非接觸共培養(yǎng)模式更強,增殖的MSC進一步促進了HSC的增殖,從而形成良性循環(huán),增強了HSC的增殖能力。3.相較于HSC單獨培養(yǎng)模式和非接觸共培養(yǎng)模式而言,2D接觸共培養(yǎng)模式能模擬一個更加接近于自然狀態(tài)下的骨髓微環(huán)境,因此更加有利于造血干細胞的體外增殖。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

圖 1 分離出的小鼠股骨（箭頭標示處可見股骨頭完好）Figure 1 Theisolated mouse femur圖 2 分離出的小鼠脛骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培養(yǎng)（1）將細胞懸液吹打混勻并計數(shù)細胞后，調整細胞密度為 1×107個/ml，每瓶 3ml 細胞懸液，接種于 25cm 培養(yǎng)瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。將這代細胞標記為 P0 代細胞。（2）接種細胞后 48 小時半量換液一次。吸取上層培養(yǎng)基 1.5ml，棄于廢液桶，并加入新鮮培養(yǎng)基 2ml，吹打混勻。以后每 48h 全量換液

圖 1 分離出的小鼠股骨（箭頭標示處可見股骨頭完好）Figure 1 Theisolated mouse femur圖 2 分離出的小鼠脛骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培養(yǎng)（1）將細胞懸液吹打混勻并計數(shù)細胞后，調整細胞密度為 1×107個/ml，每瓶 3ml 細胞懸液，接種于 25cm 培養(yǎng)瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。將這代細胞標記為 P0 代細胞。（2）接種細胞后 48 小時半量換液一次。吸取上層培養(yǎng)基 1.5ml，棄于廢液桶，并加入新鮮培養(yǎng)基 2ml，吹打混勻。以后每 48h 全量換液

圖 3 分離出的 GFP 小鼠腿骨（可見股骨頭完好，肌肉組織呈綠色Figure 3 Isolated GFP mouse leg (visible femoral head intact, muscle tissugreen)2.2 密度梯度離心法獲取小鼠骨髓 MNC1）將獲得的細胞懸液混勻，濾網(wǎng)過濾去除骨渣。1200 r 離心去上清液，用 1.5 mlPBS 重懸并吹打混勻。2）小鼠 Ficoll 分離液提前復溫，移液管吸取 2 ml 加入離心用移液槍沿管壁緩慢注入上述已混勻的細胞懸液，細胞懸液，避免 2 者混合，可見明顯的分界線。（圖 4）20 ℃、400 min。

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