發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 17:01

【摘要】：柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16, CVA16)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus),是手足口病(Hand-foot-and-mouth Disease, HFMD)的主要致病原之一,常與另一重要病原體腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV-A71)交替或共同流行。CVA16多引起兒童的HFMD,皰疹性咽峽炎等自限性疾病,但亦可引起患者出現(xiàn)心肌炎、心包炎、無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和肺炎等重癥并發(fā)癥,甚至可導(dǎo)致死亡。CVA16在我國(guó)多個(gè)地區(qū)引起過(guò)暴發(fā)流行,成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前尚無(wú)控制CVA16感染的有效藥物及手段。隨著EV-A71疫苗的即將上市,CVA16所引發(fā)的HFMD等疾病的流行將更加引起大家的重視。目前國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)致力于CVA16疫苗的研究,取得了很大的進(jìn)展,但至今仍未開(kāi)發(fā)出具有醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值的疫苗。目前研究的疫苗形式包括全病毒滅活疫苗、病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗、重組VP1亞單位疫苗、DNA疫苗等類型。病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗由于形態(tài)上與天然病毒粒子相似、具有更全的抗原表位、不含感染性的核酸、安全性更高,是一種更具開(kāi)發(fā)潛力的新型疫苗類型。CVA16 VLPs疫苗雖然之前有過(guò)報(bào)道,但缺乏更深入的研究,如不同免疫途徑對(duì)免疫效果的影響,夠疫產(chǎn)生的特異性抗體的變化規(guī)律,及對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用的具體指標(biāo)均沒(méi)有詳細(xì)的報(bào)道。因此,研究我國(guó)CVA16流行株基因特征,評(píng)估CVA16 VLPs疫苗的免疫保護(hù)性,對(duì)我國(guó)CVA16疫苗的研發(fā)兒有重要的參考價(jià)值。本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)CVA16代表株的全基因序列的測(cè)定,闡明我國(guó)CVA16的分子流行病學(xué)情況及其全基因組特征。鑒定篩選了CVA16疫苗候選株,應(yīng)用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備了較高純度的CVA16 VLPs。并應(yīng)用滅活CVA16及重組衣殼蛋白VP1做免疫比較,利用ICR小鼠模型評(píng)價(jià)該疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫效果,并對(duì)該疫苗的保護(hù)性進(jìn)行了評(píng)估 通過(guò)對(duì)新生乳鼠攻毒后組織器官的病理學(xué)、免疫組化及病毒載量的檢測(cè),進(jìn)一步分析了病毒侵入機(jī)體后增殖的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程及對(duì)各個(gè)組織器官造成的損傷,更為深入的闡釋了對(duì)候選疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)作用進(jìn)行全面評(píng)估的價(jià)值及意義。結(jié)果表明,該VLPs疫苗對(duì)小鼠具有良好的免疫保護(hù)效果,能有效阻止病毒對(duì)機(jī)體的侵襲及增殖,是極具開(kāi)發(fā)前景的疫苗形式。本研究工作主要包括3個(gè)部分。第一部分：我國(guó)CVA16代表株基因組基因特征分析我們挑選具有代表性的CVA16陽(yáng)性株,應(yīng)用特異性引物對(duì)其全基因組進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。將VPl序列及全基因組序列分別與GenBank中CVA16序列進(jìn)行比對(duì),并應(yīng)用Bio Edit、MEGA及Sim plot軟件進(jìn)行種系進(jìn)化分析、基因組特征及重組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國(guó)現(xiàn)在流行的CVA16均為B1亞型中的B1a和B1b進(jìn)化支,一直沒(méi)有B1c進(jìn)化支的報(bào)道；且中國(guó)大陸CVA16的流行亞型也未發(fā)現(xiàn)有明顯的地域性差異,不同地區(qū)流行的毒株在親緣關(guān)系樹(shù)上無(wú)明顯的分簇。全基因組研究發(fā)現(xiàn),中國(guó)流行的CVA16是多種A組腸道病毒的多重重組病毒,重組主要發(fā)生在5'UTR及非結(jié)構(gòu)蛋白P2、P3編碼區(qū)。CVA16 B1a及B1b進(jìn)化支在傳播流行過(guò)程中,比較穩(wěn)定；亞型內(nèi)及亞型間均具有較高的核苷酸及氨基酸同源性。推測(cè)中國(guó)所有流行株可能為同一祖先獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)。CVA16這種緩慢的進(jìn)化及變異成為疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)有利條件。第二部分：CVA16 VLPs疫苗的制備及鑒定根據(jù)本研究中分子流行病學(xué)研究結(jié)果及流行現(xiàn)狀,我們選取CVA16 B1b亞型毒株521-01T作為CVA16疫苗研制的候選株。對(duì)病毒P1及3CD蛋白的全長(zhǎng)編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后克隆入同一桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pFastBac-Dual中,Pl及3CD分別由啟動(dòng)子PPH及Pp10控制。進(jìn)一進(jìn)對(duì)質(zhì)粒啟動(dòng)子進(jìn)行改造,將控制3CD的P10啟動(dòng)子改為啟動(dòng)效率稍你的('MV啟動(dòng)子。分別構(gòu)建出重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-P1-3CD及Bacmid-C-P1-3CD轉(zhuǎn)染Sf9蟲(chóng)細(xì)胞獲得表達(dá)P1和3CD的重組桿狀病毒(AcMNPV-P1-3CD)及AcMNPV-C-P1-3CD).使用IFA、Western-blot及電鏡對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析 通過(guò)優(yōu)化MOI仇及表達(dá)時(shí)間,并應(yīng)用懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞進(jìn)行VLPs的大量表達(dá)；層析及密度梯度離心法純化VLPs顆粒。同時(shí),應(yīng)用VERO細(xì)胞培養(yǎng)并獲得純化的滅活CVA16全病毒,并應(yīng)用原核表達(dá)體系,獲得純化并復(fù)性的病毒衣殼蛋白VP1,分別進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,表達(dá)的P1蛋白前體被3CD蛋白酶切割為衣殼蛋白VP0、VP1及VP3并自主裝配成了CVA16 VLPs,且該VLPs結(jié)構(gòu)完整,大小位于25-30nm之間,與完整病毒顆粒一致。且啟動(dòng)子改造后能明顯提高VLPs的表達(dá)量。通過(guò)超速離心純化獲得了高純度的CVA16 VLPs。并獲得純化的CVA16滅活病毒及充足VP1蛋白。第三部分：CVA16 VLPs疫苗的免疫學(xué)特性研究選用6周齡雌性ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)估三種抗原免疫效果。優(yōu)化免疫劑量,并將三種抗原分別配伍Al(OH)3佐劑及CpG佐劑以肌肉注射的方式,配伍CpG佐劑以滴鼻免疫的方式在第0天、14天和28天進(jìn)行三次免疫。通過(guò)檢測(cè)CVA16特異性抗體、中和抗體滴度和T細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)探討抗原刺激機(jī)體所產(chǎn)生的細(xì)胞和體液免疫效果,并通過(guò)對(duì)免疫后小鼠配種所產(chǎn)乳鼠病毒攻擊實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)三種疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生的被動(dòng)保護(hù)作用。并對(duì)實(shí)驗(yàn)乳鼠的組織器官進(jìn)行HE染色、免疫組化等實(shí)驗(yàn)分析,獲得病理?yè)p傷和病原學(xué)變化資料,從而揭示疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果顯示,注射免疫途徑：CVA16 VLPs和滅活CVA16全病毒組均能刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體(血清IgG抗體均可達(dá)1:2×105)。VLPs誘導(dǎo)抗體中和活性與滅活CVA16相當(dāng),均可達(dá)到1：512。T細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),CVA16 VLPs可刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫反應(yīng),機(jī)體產(chǎn)生的特異性IFN-γ分泌T淋巴細(xì)胞數(shù)目與滅活CVA16全病毒組的相當(dāng)(P0.05),可以推測(cè)CVA16 VLPs免疫小鼠能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體Th1和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)。黏膜免疫途徑：滅活CVA16全病毒組無(wú)論在體液免疫還是細(xì)胞免疫效果方面均略優(yōu)于CVA16 VLPs組(P0.05)。且sIgA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),除呼吸道中二者sIgA滴度均可達(dá)210以上(P0.05), CVA16全病毒組在腸道及陰道灌洗液中sIgA滴度要高于CVA16 VLPs組。而VP1免疫組雖然可以誘導(dǎo)高滴度的IgG抗體,但該抗體中和效價(jià)均低于1:8,且細(xì)胞免疫水平均明顯低于VLPs免疫組(P 0.05),而且?guī)缀鯔z測(cè)不到sIgA。被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CVA16 VLPs及滅活疫苗免疫組小鼠均能對(duì)1 000LD50同株病毒及400LD50異種病毒的攻擊具有100%的保護(hù)。且最高對(duì)于16000LD5o同株病毒的攻擊,VLPs組及CAV組仍分別具有92.3%及90%的保護(hù)力；VLPs免疫組對(duì)2400 LD5o異株病毒的攻擊仍具有90%的保護(hù)。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,PBS對(duì)照組多個(gè)組織器官均出現(xiàn)病理性變化,以后肢肌肉、腸組織、肺臟最為嚴(yán)重；出現(xiàn)了嚴(yán)重的肌纖維萎縮、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn),腸壁水腫壞死、絨毛脫落,肺泡壁增厚、水腫等病理學(xué)變化。CVA16 VLPs及滅活病毒免疫組在各個(gè)組織器官(腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、后肢骨骼肌、脊柱骨骼肌及脊髓)均無(wú)組織病理學(xué)變化。器官病原學(xué)分布與病理表現(xiàn)基本一致,PBS對(duì)照組各個(gè)組織器官中均可檢測(cè)到大量病毒存在。但免疫組小鼠在后肢骨骼肌組織、腸組織等處可檢測(cè)到微量的病毒抗原存在,其余器官病原學(xué)分布皆呈陰性。以上結(jié)果說(shuō)明CVA16 VLPs可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)；且該中和抗體能明顯抑制病毒在小鼠體內(nèi)一些組織器官中的增殖,能在很大程度上夠阻止病毒的感染,有效的保護(hù)機(jī)體免受病毒感染所引起的病理?yè)p害。本研究闡明了我國(guó)CVA16病毒代表株的全基因組基因特征,成功構(gòu)建并證實(shí)了CVA16 VLPs具有和滅活疫苗相同的保護(hù)作用,說(shuō)明CVA16 VLPs疫苗是—種很有開(kāi)發(fā)前景的候選疫苗。這些結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)CVA16 VLPs組裝及結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行深入研究、以及進(jìn)行下游的開(kāi)發(fā)和免疫學(xué)方面的研究提供了參考,為CVA16疫苗的研制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392-33
【圖文】：

３．１邐ＣＭＶ啟動(dòng)子的擴(kuò)X楀義銜頤怯τ茫校茫曳椒ù櫻穡悖模五澹粒常敝柿Ｖ欣椈竦茫茫灣澹旨綞有蛄釁�，道i懼義咸醮繽跡玻彼荊壞纈窘峁玫皆て詿笮〉模茫停中蛄釁危ǎ叮擔(dān)埃猓穡�，矎T蚪徨義瞎允居朐夾蛄幸恢�。逦亓x希灣澹五澹卞危插義希猓皰義希玻埃埃板邋五義希保埃埃板濉義希擔(dān)埃板巍叮常板義希玻擔(dān)板濉義希保埃板五義賢跡玻卞澹茫停制舳有蛄校校茫依┰黿峁義希疲椋紓酰潁邋澹玻保澹裕瑁邋澹潁澹螅酰歟簦簀澹媯錚蟈澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹錚駑澹茫停皺澹穡潁錚恚錚簦澹蟈義希停哄澹模危鈴澹恚幔潁耄澹蟈弭蓿停玻埃埃埃誨澹危哄澹危澹紓幔簦椋觶邋澹悖錚睿簦潁錚歟誨澹保Γ玻哄澹茫停皺澹穡潁錚恚錚簦澹蟈義希常插危穡疲�；e擔(dān)幔悖模酰幔歟茫停指腦熘柿５募ㄥ義轄拗菩閱誶心穡攏螅簦歟歟埃峰澹校輳櫻恚徨澹擅蓋瀉蠡厥盞模茫停趾蠖似渭懊蓋瀉簀義現(xiàn)柿＃穡疲幔缶桑幔悖模酰幔旖卸ㄏ蛄櫻穡疲幔缶桑幔悖模酰崛玫模校保昂蠖猶婊晃茫停皺義蝦蠖櫻故齔尚碌母腦熘柿＃穡疲幔螅簦攏幔悖模酰幔歟茫停鄭⒔媯歟校茫乙宀馇杉ǎ哄義咸匾煨裕校茫依┰黽齲夯ㄌ厥砸錚ǎ茫疲義澹┴濁扇韁是懾義希穡疲幔螅簦攏幔悖模酰幔歟茫停紙潁у澹校茫依┣桑傻剿鍍諶誦〉模茫灣澹幀６飼閃釁五義希ǎ叮擔(dān)埃猓穡�，见间２－２。辶x希罰峰義

本文編號(hào)：2745367