【摘要】：目的：探討內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子2(ECSM2)的功能學(xué)表位,ECSM2與其他內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子之間的關(guān)系,ECSM2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響,以及ECSM2分子在血管新生性疾病組織中的表達(dá)。 方法： 1.利用CBS Prediction Servers生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ECSM2分子功能學(xué)表位；通過(guò)定點(diǎn)PCR突變技術(shù)將胞外段第54位酪氨酸突變?yōu)楸彼?Y54A),構(gòu)建表達(dá)Y54A突變的ECSM2真核表達(dá)載體pECSM2Y54A GFP和pECSM2Y54A3FLAG。 2.將真核表達(dá)ECSM2wild type和Y54A突變的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光和免疫共沉淀明確ECSM2分子的膜定位和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和跨孔實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ECSM2分子對(duì)細(xì)胞遷移的影響。 3.用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC,利用免疫印跡和免疫共沉淀檢測(cè)ECSM2分子與VE-Cadherin分子之間的關(guān)系。 4.將HUVEC細(xì)胞接種Matrigel,用Real Time PCR檢測(cè)體外血管新生過(guò)程中ecsm2基因表達(dá)水平的變化；用siRNA干擾技術(shù)抑制ecsm2基因表達(dá),用Tube formation assay和in vitro permeability assay觀察對(duì)體外血管形成及血管穩(wěn)定性的影響。 5.收集46例肝臟惡性腫瘤標(biāo)本(包括腫瘤組織和癌旁組織),做免疫組化分析,結(jié)合病人資料采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果： 1. ECSM2分子胞外段潛在功能位點(diǎn)為1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(Y54, tyrosine)、12個(gè)絲／蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化(N96, Asparagine)和23個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。胞內(nèi)段有7個(gè)可能的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。 2. ECSM2分子胞外段第54位酪氨酸殘基突變(Y54A)不影響ECSM2分子的膜定位；該位點(diǎn)被證實(shí)為酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。Y54A突變解除了ECSM2分子對(duì)細(xì)胞遷移的抑制。 3. VEGF刺激HUVEC,促進(jìn)ECSM2與VE-cadherin分子間結(jié)合。 4. ECSM2分子在體外血管形成中轉(zhuǎn)錄水平降低,與血管穩(wěn)定性維持相關(guān)。 5. ECSM2在肝臟惡性腫瘤組織中表達(dá)水平升高。 結(jié)論：ECSM2分子第54位酪氨酸殘基是酪氨酸磷酸化位點(diǎn),該位點(diǎn)突變不影響ECSM2分子膜定位,但阻遏了ECSM2對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)性細(xì)胞遷移的抑制,提示該位點(diǎn)參與ECSM2分子對(duì)細(xì)胞遷移的影響機(jī)制；在內(nèi)皮細(xì)胞中,VEGF刺激引起ECSM2與VE-cadherin表達(dá)增多,分子間結(jié)合增強(qiáng)；功能學(xué)上,ECSM2分子維持血管穩(wěn)定性與通透性；在血管新生性疾病,如肝癌組織中,ECSM2分子表達(dá)升高。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329
【圖文】：

從健康嬰兒肪靜脈中分離獲得的原代HUVEC細(xì)胞，在接種培養(yǎng)18h之后開(kāi)始貼壁（圖2A1)，在第2-3日細(xì)胞即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速（圖2A2)；第5-6日時(shí)鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣形態(tài)特征，細(xì)胞邊界清楚，胞團(tuán)豐富，細(xì)胞核清晰，核分裂像可見(jiàn)1-2個(gè)核仁融合成片的細(xì)胞，呈鵝卵石樣排列（圖2A3)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)符合原代HUVEC細(xì)胞的特征，滿足實(shí)驗(yàn)要求。將HUVEC消化成懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞活力，為90%-95%；繼而進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記即內(nèi)皮細(xì)胞1?粘蛋白VE-cadherin免疫突光染色鑒定細(xì)胞及純度

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本文編號(hào)：2732307