【摘要】：基質(zhì)硬度對細胞的遷移、增殖、分化等多種功能和行為產(chǎn)生重要影響。目前,臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)因其強大的自我更新與多向分化的能力已成為細胞治療的理想來源。不同基質(zhì)硬度可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)呈現(xiàn)不同的分化方向,尤其在軟基質(zhì)MSCs向神經(jīng)方向分化。但在分化過程中,細胞如何感應(yīng)基質(zhì)硬度并將力學(xué)信號刺激轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號的分子機制尚不明確。本研究通過制備不同硬度的基質(zhì),選用UC-MSCs作為研究對象,通過qPCR及Western Blot檢測基質(zhì)硬度誘導(dǎo)UC-MSCs成神經(jīng)分化過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(Bone morphogenetic protein receptor,BMPR)發(fā)揮的作用及其分子機制。根據(jù)課題組前期工作,采用丙烯酰胺與雙丙烯酰胺聚合交聯(lián)制備聚丙烯酰胺水凝膠(Polyacrylamide,PAAM),從而成功獲得硬度分別為1-10 kPa、35-38kPa和62-68 kPa的基質(zhì)。將UC-MSCs培養(yǎng)在不同硬度的基質(zhì)上,鏡下觀察到UC-MSCs的細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化。前期研究結(jié)果表明,細胞在35-38 kPa的基質(zhì)上培養(yǎng),細胞形態(tài)呈現(xiàn)為針形,類似于肌細胞;而在62-68 kPa的基質(zhì)上培養(yǎng),細胞形態(tài)呈現(xiàn)多角形,類似于成骨細胞。而在1-10 kPa的基質(zhì)上,觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)呈現(xiàn)橢圓形,類似于神經(jīng)細胞。通過qPCR及Western blot的方法分別檢測在三組基質(zhì)硬度上神經(jīng)細胞標志物Nestin和βIII tubulin的表達,結(jié)果顯示,在1-10 kPa的基質(zhì)上,UC-MSCs高表達神經(jīng)標志物Nestin和βIII tubulin,表明1-10 kPa基質(zhì)硬度可誘導(dǎo)UC-MSCs成神經(jīng)方向分化。為探究在此分化過程BMPR發(fā)揮的作用,在三組不同硬度的基質(zhì)上分別檢測UC-MSCs的BMPR的表達水平,結(jié)果顯示在硬度為1-10 kPa的基質(zhì)上,UC-MSCs高表達BMPR。在加入BMPR抑制劑(LDN-193189)之后,在1-10kPa的基質(zhì)上,UC-MSCs神經(jīng)相關(guān)標志物Nestin和βIII tubulin表達量明顯降低,由此證明BMPR確實參與了該分化過程。為探究BMPR下游的分子機制,通過Western blot檢測BMPR下游相關(guān)蛋白Smad及整合素下游相關(guān)蛋白AKT、GSK-3β和FAK的表達水平,結(jié)果表明,加入BMPR抑制劑后,在1-10 kPa上Smad蛋白磷酸化水平降低,AKT、GSK-3β和FAK的表達水平也明顯受到抑制。因此認為BMPR下游可能通過Smad通路發(fā)揮作用,并可能與整合素下游發(fā)生cross-talk。另外,將鈣離子熒光探針裝載到UC-MSCs內(nèi),發(fā)現(xiàn)當加入BMPR抑制劑后,細胞內(nèi)熒光探針所產(chǎn)生的Ca~(2+)熒光強度也隨之降低,因此認為鈣離子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能也參與了UC-MSCs神經(jīng)分化過程。綜上所述,在本研究中,成功制備了不同硬度的基質(zhì),并在硬度為1-10 kPa的基質(zhì)上發(fā)現(xiàn)UC-MSCs能夠向神經(jīng)方向分化。BMPR在此分化過程中發(fā)揮重要作用,此作用可能是通過調(diào)節(jié)Smad蛋白,也可能通過與整合素發(fā)生cross-talk從而影響分化過程。而鈣離子介導(dǎo)的信號途徑也可能參與此調(diào)控過程,對進一步揭示基質(zhì)硬度誘導(dǎo)UC-MSCs成神經(jīng)分化的復(fù)雜的分子機制具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

第 3 章 實驗結(jié)果 hUC-MSCs 的培養(yǎng)與鑒定.1 hUC-MSCs 的原代培養(yǎng)通過組織塊培養(yǎng)法從正常足月胎兒的臍帶華通膠組織中分離得到大量狀的原代 hUC-MSCs。剪碎的組織塊在 5-7 天觀察可見爬出少量長梭形、的幼稚細胞，細胞呈現(xiàn)單個核，折光性強，細胞邊緣清晰。待細胞密度80~90%融合時，可以發(fā)現(xiàn)細胞成漩渦狀生長，傳代時棄去組織塊。之后每 天傳代，傳至第 5 代時，觀察 hUC-MSCs 已經(jīng)逐漸純化，一些混雜細胞，hUC-MSCs 的形態(tài)更加均一，為長梭形。將細胞擴增至第 5代凍存?zhèn)溆脙龃婧髲?fù)蘇，其形態(tài)與凍存前并無明顯變化。實驗所用細胞為狀態(tài)良好5-7代 hUC-MSCs。如圖 3.1所示。

（A） 剝離血管后剪碎的華通膠組織。（B）組織塊第 5天爬出多角形、長梭形細胞。Scale bar=200 μm（C）P5 代 hUC-MSCs，呈漩渦狀。Scalebar=50 μm（D）凍存后復(fù)蘇 P6 代 hUC-MSCs。Scale bar=200 μm.1.2 hUC-MSCs 的鑒定為驗證分離培養(yǎng)的細胞是否具有 MSCs 的特性，接下來對獲得的細胞進行定。采用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs 不表達造血細胞標記 CD34，CD45，高表達黏附分子 CD44，CD90 以及人間充質(zhì)干細胞標記 CD105。同時免疫熒檢測細胞表面標記物發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs陰性表達 CD34，CD45，陽性表達 CD44，D73，CD90，CD105，結(jié)果與流式結(jié)果相一致。提示獲得的 hUC-MSCs 具有間質(zhì)干細胞的表型特征。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yan Li;Meimei Liu;Yuanwei Yan;Shang-Tian Yang;;Neural differentiation from pluripotent stem cells:The role of natural and synthetic extracellular matrix[J];World Journal of Stem Cells;2014年01期

本文編號：2726575