【摘要】：鈣離子在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)膜之間的流動(dòng)對(duì)神經(jīng)元的基礎(chǔ)功能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存細(xì)胞器,參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣平衡,調(diào)控各種信號(hào)通路,介導(dǎo)細(xì)胞蛋白合成、信號(hào)傳導(dǎo)等過程。本實(shí)驗(yàn)以小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)細(xì)胞體外定向分化神經(jīng)元為模型,模擬胚胎神經(jīng)發(fā)育過程,考察若干鈣調(diào)控蛋白在小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及神經(jīng)發(fā)生中的作用。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子動(dòng)態(tài)平衡過程由蘭尼堿受體(ryanodine receptors, RyRs)、IP3受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptors, IP3Rs)以及肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)協(xié)調(diào)運(yùn)作控制。其中,SERCA蛋白能量依賴性的鈣回調(diào)作用對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣平衡至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)考察了ES細(xì)胞神經(jīng)元分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及鈣釋放特征,并探索SERCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在作用及可能的分子機(jī)制。 Junctophilins (JPs)是一類被證實(shí)存在于興奮期細(xì)胞中的Ca2+平衡調(diào)控蛋白,神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Junctophilin 3 (JP-3), Junctophilin 4 (JP-4)兩種亞型。Jp-3,Jp-4基因敲除小鼠特征性表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能失常、平衡能力損傷并伴有記憶損傷。本研究利用ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元模型,探索Jp-3,Jp-4在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中的作用。 第一章SERCA在小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存以及神經(jīng)突起發(fā)育中的作用 目的：探索小鼠胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及鈣釋放特征,并探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵蛋白SERCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在的作用。 方法：采用經(jīng)典的4-/4+法誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元,10-7mol/L全反式維甲酸(Retinoic acid, RA)為陽(yáng)性對(duì)照,0.1%二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對(duì)照。在分化培養(yǎng)終點(diǎn)(貼壁鋪展培養(yǎng)d 8+10),光鏡和免疫熒光成像法鑒定神經(jīng)元形成(軸突長(zhǎng)度是胞體長(zhǎng)度的3倍及以上),細(xì)胞微管蛋白(p-tubulinⅢ)陽(yáng)性。分別收集ES細(xì)胞、擬胚體(embryoid bodies, EBs)、貼壁培養(yǎng)d 8+0、d 8+5和d 8+10細(xì)胞樣本,以RT-PCR及Western-blot法,評(píng)價(jià)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)鈣調(diào)控蛋白R(shí)yRs. IP3受體及SERCA在各個(gè)神經(jīng)分化時(shí)期表達(dá)特征。以神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白(nestin),成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白(p-tubulinlll),神經(jīng)軸突標(biāo)志蛋白(neurofilaments, NEFM)和神經(jīng)樹突標(biāo)志蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP2)表達(dá)評(píng)價(jià)分化情況；FM1-43熒光染色觀察分化成熟神經(jīng)元囊泡攝取功能。選取分化早期d 8+3神經(jīng)前體細(xì)胞及d 8+10分化成熟神經(jīng)元,經(jīng)由活細(xì)胞工作站檢測(cè)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能。以10-6mol/L SERCA抑制劑(cyclopiazonic acid, CPA)論證SERCA對(duì)神經(jīng)分化的特定作用。觀察CPA是否影響RA促神經(jīng)分化作用及神經(jīng)元囊泡攝取功能。同時(shí)利用Western-blot法檢測(cè)MAPK通路中ERK, JNK, p38磷酸化等相關(guān)分子事件的變化,以探索RA促神經(jīng)分化過程SERCA的可能機(jī)制。 結(jié)果：小鼠ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣相關(guān)蛋白SERCA、RyRs和IP3Rs表達(dá)均隨分化時(shí)相依賴性上調(diào)。神經(jīng)前體細(xì)胞即具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能,成熟神經(jīng)元中此功能進(jìn)一步增強(qiáng)。SERCA抑制劑CPA能顯著減少RA促ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞,抑制神經(jīng)元軸突和樹突發(fā)育,并抑制神經(jīng)元囊泡攝取功能。提示SERCA具有調(diào)控神經(jīng)分化作用,特別體現(xiàn)在促軸突和樹突發(fā)育以及囊泡攝取功能。CPA可下調(diào)MAPK通路中ERK, JNK和p38的磷酸化,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存對(duì)神經(jīng)分化調(diào)節(jié)作用尚伴隨MAPK家族蛋白的激活。 結(jié)論：RA促小鼠ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)過程,呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存及釋放功能,該功能存在于神經(jīng)細(xì)胞分化早期,且隨分化進(jìn)程呈上調(diào)趨勢(shì)。抑制SERCA鈣離子泵功能,不僅降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存,尚呈現(xiàn)抑制神經(jīng)分化作用,特別是影響軸突和樹突發(fā)育,并抑制了神經(jīng)囊泡攝取功能。神經(jīng)分化過程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化參與。 第二章Jp-3,Jp-4基因?qū)π∈驟S細(xì)胞衍生神經(jīng)元胚層發(fā)育、線粒體表達(dá)及神經(jīng)遞質(zhì)分泌的影響 目的：探索ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元Ca2+平衡調(diào)控蛋白基因(Junctophilin 3, Junctophilin 4, Jp-3, Jp-4),在神經(jīng)分化中的作用,及其與神經(jīng)元線粒體功能和神經(jīng)遞質(zhì)分泌功能的關(guān)系。 方法：小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化早期,小干擾Jp-3,Jp-4(siRNA),收集鋪展分化培養(yǎng)d 8+0、d 8+2、d 8+6、d 8+8各時(shí)期細(xì)胞樣本,RT-PCR法考察分化相關(guān)基因OCT3/4(未分化ES細(xì)胞標(biāo)志基因)、Fg35(外胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、Brachy(中胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、AFP(內(nèi)胚層發(fā)育標(biāo)志基因)、nestin(神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志基因)的表達(dá)。貼壁培養(yǎng)d 8+0、d 8+5、d 8+10(神經(jīng)分化終點(diǎn))各時(shí)期,評(píng)價(jià)線粒體融合蛋白基因Mfn1、Mfn2,過氧化物酶增殖激活受體輔酶激活因子PGC1-α及核呼吸因子NRF-1的表達(dá)特征。MitoTracker* Red標(biāo)記活細(xì)胞線粒體,細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)siJp-3, Jp-4神經(jīng)元線粒體完整性。RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞分化終點(diǎn)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志性蛋白泡狀谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporters, VGluTl),谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase 65, GAD65),乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)基因表達(dá)。 結(jié)果：siJp-3, siJp-4可顯著降低外胚層Fgf5轉(zhuǎn)錄,部分減少神經(jīng)前體細(xì)胞nestin轉(zhuǎn)錄,對(duì)其他胚層相關(guān)基因表達(dá)則影響不明顯。siJp-3, siJp-4尚可損傷線粒體完整性,表現(xiàn)為線粒體熒光強(qiáng)度降低,且在軸突和樹突內(nèi)分布減少。siJp-3, siJp-4抑制了線粒體結(jié)構(gòu)與功能基因Mfn1、Mfn2、PGC1-a及NRF-1的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),siJp-3, Jp-4也可抑制分化終點(diǎn)成熟神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志性蛋白VGluTl、GAD65、AchE的基因表達(dá),提示Jp-3,Jp-4缺失可導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)合成降低。 結(jié)論：小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化過程中,Ca2+平衡調(diào)控蛋白基因Jp-3,Jp-4正常表達(dá)與神經(jīng)分化、線粒體功能及神經(jīng)遞質(zhì)的分泌呈密切相關(guān)性。
【圖文】：

圖1.4小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元表達(dá)SERCAZb貼壁ds+lo天細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，sEReAZb(紅色)，p一tubu一in111標(biāo)記神經(jīng)元(綠色)，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色)。Bar=25協(xié)m。Fig1.4ImmunocytoehemiealstainingofESeell·derivedneurons(coloealizationwithSERCAZb).L3.2.2小鼠Es細(xì)胞神經(jīng)元定向分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道相關(guān)受體基因表達(dá)為檢測(cè)Es細(xì)胞定向分化神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣受體相關(guān)基因表達(dá)的變化，本實(shí)驗(yàn)采用Rl’-pcR法對(duì)凡五、、IP了R、sERcAZb進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖1.5)，，凡五S從ds+0天開始表達(dá)，IP了R表達(dá)始于EB期，SERCAZb則從ES期就有表達(dá)。這些ca2+受體基因在Es細(xì)胞定向發(fā)育為神經(jīng)元過程中均呈穩(wěn)定表達(dá)。

為檢測(cè)ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣受體相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)采用 westemblot法檢測(cè)助Rs，IP3R，sERcAZb蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖1.6):RyRs從ds+o天開始表達(dá)，IP3R表達(dá)始于EB期，sEReAZb則從Es期就有表達(dá)。與PcR結(jié)果相一致。這些c擴(kuò)+受體蛋白在Es細(xì)胞定向發(fā)育為神經(jīng)元過程中表達(dá)呈一定上調(diào)趨勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 劉泉;24小時(shí)內(nèi)MDMA對(duì)大鼠腦組織氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca~(2+)通道的影響[D];華中科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2711874