【摘要】：各類內(nèi)源物質(zhì)和外源化合物在人體內(nèi)的代謝是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程,過(guò)去人們認(rèn)為這種代謝可以分為兩步完成。即由細(xì)胞色素氧化酶P450(CYPs)為主要代謝酶催化的一相代謝反應(yīng)和由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)為主要代謝酶催化的二相代謝反應(yīng)。一般認(rèn)為,CYPs的主要作用是對(duì)藥物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,例如在分子結(jié)構(gòu)上加上一個(gè)羥基,使其更為親水。而UGTs的主要作用是在一相代謝的基礎(chǔ)上,將輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)上的葡萄糖醛酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到藥物分子的羥基上,使藥物水溶性提高,更利于通過(guò)尿液或膽汁排出體外。但是最新研究表明,化合物在體內(nèi)的代謝并非嚴(yán)格遵守一相至二相的順序,大多情況下,二者是同時(shí)并存關(guān)系。更有可能有些物質(zhì)只經(jīng)過(guò)CYPs代謝就排出體外,也有些本身就帶有羥基集團(tuán)的化合物不經(jīng)過(guò)CYPs催化,直接經(jīng)由UGTs代謝后排出體外。UGTs是非常重要的藥物代謝酶,可以代謝將近35%的藥物,使之失活。除藥物外,UGTs還可以介導(dǎo)致癌物質(zhì)的解毒過(guò)程,以及維持體內(nèi)內(nèi)源物質(zhì),如激素和膽紅素的體內(nèi)平衡。前文提到,UGTs的代謝解毒原理主要為在底物分子的羥基基團(tuán)上連接葡萄糖醛酸基團(tuán),使產(chǎn)物親水性提高,因而更易通過(guò)尿液或膽汁排出體外。這個(gè)過(guò)程需要輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸提供葡萄糖醛酸基團(tuán)。UGTs的底物結(jié)構(gòu)十分多樣化,除羥基外,含有羰基,羧基,巰基以及氨基的化合物都可以成為底物。事實(shí)上,整個(gè)反應(yīng)為R-OH(或R-CO,R-COOH,R-SH,R-NH2)作為親核試劑的SN2親核取代反應(yīng),最終形成了更為親水的產(chǎn)物β-D-葡糖苷酸。UGTs之所以具有多樣化的底物結(jié)構(gòu),最主要的原因是UGTs是一個(gè)具有多個(gè)同工酶的超家族。人類UGT酶有22種同工酶,可被分為四個(gè)家族,UGT1A、UGT2(可分為UGT2A和UGT2B)、UGT3和UGT8。其中UGT1A和UGT2B家族的UGT同工酶承擔(dān)了大部分的外源物質(zhì)代謝解毒過(guò)程。它們也是需要著重考慮的酶。因此,了解這些酶在體內(nèi)的分布及表達(dá)十分有助于藥物代謝的毒理學(xué)研究。肝臟作為最主要的代謝器官,多種UGT同工酶都在其中表達(dá)。其中,UGT1A家族的一些同工酶(1A1,1A4,和1A9)和UGT2B家族的一些同工酶(2B4,2B7,和2B15)表達(dá)水平相較于其他高出許多。但是其他同工酶,如UGT1A3,1A6,2B10,2B11和2B17的表達(dá)量為中等水平。而UGT1A5,1A7,1A8,1A10和2B28表達(dá)水平極低。胃腸道也是UGT酶催化代謝的主要場(chǎng)所,在藥物的代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。UGT1A1,1A4,2B7以及2B15在胃腸道中表達(dá)量相較其他較高,而UGT1A3,1A7,1A8,1A9,2B4,2B7,2B10,2B11和2B28在胃腸道中表達(dá)量極低。除此之外,腎臟中的代謝過(guò)程也是藥物解毒排出體外不可缺少的環(huán)節(jié)。腎臟中,表達(dá)水平最高的為UGT1A6,1A9以及2B7。藥物代謝意義上的藥物與藥物間相互作用是指一種藥物對(duì)代謝另一種藥物的代謝酶產(chǎn)生了影響,從而造成另一種藥物在人體內(nèi)累積而致使其濃度升高超過(guò)治療窗,產(chǎn)生毒性。UGTs在藥物代謝中發(fā)揮極其重要的作用。因此,近年來(lái)因UGTs功能受到影響而導(dǎo)致的藥物與藥物相互作用相關(guān)報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。例如,丙戊酸作為一種抗癲癇和抗抑郁藥物,服用后對(duì)人體內(nèi)UGT2B7功能具有抑制作用。而UGT2B7為一系列藥物(包括撲熱息痛,阿莫三嗪,齊多呋定)的主要代謝酶。丙戊酸與這些藥物的同時(shí)服用無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致這些藥物在人體內(nèi)的代謝過(guò)度積累,從而引起毒副作用。除藥物與藥物相互作用外,因遺傳性的基因差別而導(dǎo)致藥物代謝途徑發(fā)生改變同樣會(huì)造成藥物的藥理學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。而UGTs是一類遺傳性差異發(fā)生頻率很高的代謝酶。UGTs的單核苷酸多態(tài)性以及基因拷貝數(shù)變異普遍存在于不同人種間,因其造成的藥物代謝過(guò)程差異同樣是人們關(guān)注研究的重點(diǎn)。因變異導(dǎo)致的UGTs功能降低或缺失與多種疾病及藥物毒性反應(yīng)存在聯(lián)系。例如,抗癌藥物依替立康的抗癌療效主要依賴于其在人體內(nèi)的初始代謝物SN-38,而SN-38在具有極高的抗癌活性同時(shí),其對(duì)血細(xì)胞的毒副作用也十分明顯。而SN-38在體內(nèi)代謝過(guò)程主要由一些UGT1As負(fù)責(zé),因此UGT1As因變異導(dǎo)致的功能缺失會(huì)造成SN-38的體內(nèi)累積,產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,造成白細(xì)胞減少癥。此外,膽紅素水平是評(píng)判肝功能好壞的重要指標(biāo)。其作為內(nèi)源物質(zhì),主要由UGT1A1進(jìn)行代謝,而UGT1A1為目前已知的變異型最多的UGT同工酶。一些變異型會(huì)導(dǎo)致UGT1A1功能活性降低,從而使血液中膽紅素水平升高,有可能造成黃疸�，F(xiàn)今,研究各個(gè)UGT同工酶功能的方法有很多。較為常見(jiàn)的是使用人肝微粒和微生物或細(xì)胞系重組表達(dá)UGT酶作為酶源,來(lái)研究單個(gè)同工酶的活性區(qū)別。但這些方法各有利弊。人肝微粒的好處是,儲(chǔ)存及使用簡(jiǎn)便,反應(yīng)時(shí)間短,適合高通量篩選底物。而其缺點(diǎn)亦十分明顯,人肝微粒造價(jià)昂貴,來(lái)源困難,存在批次差異,以及無(wú)法用于研究一些只在肝外表達(dá)的UGT同工酶。而另一種較為常用的方法是微生物(如大腸桿菌或酵母)重組表達(dá)人類UGTs。在本組之前的實(shí)驗(yàn)研究中,曾用裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)成功共表達(dá)了人類19種UGT同工酶(UGT1A和UGT2家族)以及其輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA),并基于此進(jìn)行了一系列全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)楣脖磉_(dá)了輔因子,因此無(wú)需在反應(yīng)體系中人為投放輔因子,大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。但是這種全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)也很明顯。UGTs位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)側(cè),屬于膜蛋白。全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化方法中,因?yàn)橥暾?xì)胞具有多層的生物屏障(如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜),底物穿透這些屏障到達(dá)UGT酶位置進(jìn)行生物反應(yīng)的過(guò)程受到阻礙,而生成的產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)同樣的生物屏障排出細(xì)胞外。因而此種方法產(chǎn)率低,耗時(shí)長(zhǎng)。為了克服這些缺點(diǎn),在本項(xiàng)研究中,我們建立并優(yōu)化了基于滲透性重組表達(dá)人類UGTs的裂殖酵母的研究方法。此種方法將裂殖酵母細(xì)胞用適當(dāng)滲透劑處理,使其表面細(xì)胞膜形成孔洞。這些孔洞大小可允許底物,輔因子以及產(chǎn)物分子自由進(jìn)出,而UGTs因其分子結(jié)構(gòu)過(guò)大而留在細(xì)胞內(nèi),因而反應(yīng)時(shí)間縮短,產(chǎn)率提高,獲得更高效率比。我們將這種方法稱為酶包法。為了驗(yàn)證酶包法的實(shí)行的可能性以及高效率,我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先,因?yàn)闈B透劑不但會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生影響,而且高濃度情況下還會(huì)影響酶的活性。因此,我們探究了一系列滲透劑濃度對(duì)UGT酶活性的影響,同時(shí)使用人肝微粒作為對(duì)照�；诒窘M之前的實(shí)驗(yàn)研究,我們選擇Triton X-100作為滲透劑。研究結(jié)果表明相較于人肝微粒,遞增的Triton X-100濃度與UGT活性成正比,并在0.3%濃度時(shí)達(dá)到最高。因此在后續(xù)研究中,酶包法中Triton X-100濃度被固定為0.3%。此項(xiàng)試驗(yàn)證明了酶包方法在運(yùn)用于UGT酶上的可能性。隨后,為了證明酶包法的高效性,我們選取11α-羥基孕酮作為底物,分別進(jìn)行酶包法轉(zhuǎn)化和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示,酶包法獲得的產(chǎn)物為全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法獲得產(chǎn)物的將近四十倍,這一數(shù)據(jù)有力證明了酶包法的高效性。接著,我們使用酶包法進(jìn)行了酶活性抑制實(shí)驗(yàn),成功測(cè)定了甲芬那酸抑制UGT1A9的IC50值,所得數(shù)據(jù)(IC504.1μM,with a 95%CI of 2.5 to 6.4μM R2=0.97)與之前被發(fā)表過(guò)的數(shù)據(jù)十分接近。使用普羅麥格公司(Promega)提供的發(fā)光底物,我們成功為三種UGT同工酶(UGT1A5,UGT2B11,和UGT2B28)發(fā)現(xiàn)了新底物。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)UGT1A5還可以催化氨基的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移反應(yīng),這是從未被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道過(guò)的。此外,對(duì)于UGT1A5錯(cuò)義突變的生物信息學(xué)研究表明,UGT1A5有兩個(gè)之前從未被發(fā)現(xiàn)的變異型,其一為九倍突變(UGT1A5*8),其二為六倍突變(UGT1A5*9)。我們成功在裂殖酵母中表達(dá)了這兩種突變型,并以野生型UGT1A5作為對(duì)照,使用發(fā)光底物測(cè)試了其活性。結(jié)果表明,無(wú)論是O-葡萄糖醛酸化還是N-葡萄糖醛酸化,UGT1A5*8的活性總是高于UGT1A5*9和野生型UGT1A5。同源建模和分子底物對(duì)接研究表明,在所有突變中,UGT1A5*8中的Gly259Arg突變?yōu)殛P(guān)鍵性因素。該突變通過(guò)新形成的氫鍵網(wǎng),穩(wěn)定了helix Q的結(jié)構(gòu)。相較于野生型UGT1A5,該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有助于輔因子與酶的結(jié)合。最后,因?yàn)轶w育競(jìng)賽中興奮劑濫用情況日漸猖獗,而興奮劑的UGTs代謝產(chǎn)物在興奮劑檢測(cè)和監(jiān)控中起到重要作用,我們決定使用基于UGTs的酶包法對(duì)興奮劑的代謝情況進(jìn)行一定研究。此次實(shí)驗(yàn)中,我們使用酶包法研究了19種人類UGT酶對(duì)興奮劑普萘洛爾及其一相代謝產(chǎn)物4-羥基普萘洛爾的代謝情況。除了已被發(fā)現(xiàn)的UGT1A9,我們還發(fā)現(xiàn)了兩種新的UGT同工酶(UGT1A7和UGT1A8)也可以代謝普萘洛爾和4-羥基普萘洛爾。此外,4-羥基普萘洛爾還被另一種UGT同工酶(UGT2A1)代謝。更為有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)了UGT1A7,UGT1A8和UGT1A9均對(duì)普萘洛爾具有立體選擇性。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R341

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8 戴佩e(cuò)，

本文編號(hào)：2692066