【摘要】：持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒是誘發(fā)女性宮頸癌的主要原因。人乳頭瘤病毒是一類無包膜DNA病毒,其病毒衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2構成,其中,L2蛋白在病毒感染細胞的過程中發(fā)揮重要作用,包括病毒吸附、入胞、免疫逃逸、攜帶病毒基因組入核和病毒顆粒組裝等過程。但目前L2蛋白三維結構至今尚未解析出,衣殼蛋白L1與L2的相互作用也未研究清楚,尤其是L2蛋白中與L1蛋白相互作用關鍵位點完全未知。因此,闡述HPV次要結構蛋白L2與主要結構蛋白L1的相互作用關鍵位點及其功能對HPV病毒學研究具有重要意義。為了探討HPV次要結構蛋白L2與主要結構蛋白L1的相互作用關鍵位點及其功能,本論文進一步深入分析研究本課題組前期鑒定的L1五聚體內(nèi)腔中四個影響病毒感染且可能與L2蛋白相互作用的關鍵殘基(F256,R315,Q317和T340)的功能。首先,大規(guī)模制備L1-F256A、L1-R315A、L1-Q317A和L1-T340A突變假病毒,超速離心純化獲得較高純度的突變病毒顆粒,利用ELISA和Western blotting分析突變病毒顆粒中次要結構蛋白L2構象變化和含量變化,檢測結果發(fā)現(xiàn)除L1-F256A外,其余突變病毒顆粒中L2蛋白的含量較野生型顯著降低,而在293FT細胞中發(fā)現(xiàn)四個突變假病毒的L2表達水平與野生型相當,即L1位點突變不影響L2表達,從而證明R315,Q317和T340這三個關鍵位點的突變導致病毒顆粒組裝后L2蛋白含量減少;同時利用HPV16 L2抗體14H6檢測發(fā)現(xiàn)F256突變后導致病毒顆粒中L2的14H6表位構象發(fā)生改變;進一步利用免疫熒光實驗分析突變假病毒吸附和入胞能力的變化,檢測結果顯示4個位點突變后不影響假病毒吸附細胞外基質(zhì)和細胞膜,但阻礙了假病毒內(nèi)吞入胞。上述研究表明L1-F256、R315、Q317和T340對病毒感染極其重要,并且參與病毒主要結構蛋白和次要結構蛋白的相互作用。由于尚無次要結構蛋白L2的結構信息,我們首先分析L2蛋白的一級結構信息,利用軟件分析其帶電荷情況和預測蛋白質(zhì)折疊后殘基暴露情況,再基于L1四個關鍵氨基酸的性質(zhì),從L2中選取帶負電荷和親水的且暴露在表面的氨基酸進行突變分析,利用上述分析L1突變假病毒性質(zhì)與功能的方法研究L2突變假病毒的性質(zhì)與功能。病毒感染分析實驗發(fā)現(xiàn)L2-D337A-D338A-D340A和L2-D329A突變假病毒感染能力顯著下降;利用雙抗夾心ELISA和蛋白免疫印記分析突變假病毒中L1與L2蛋白的含量及構象變化,檢測發(fā)現(xiàn)L2-D337A-D338A-D340A三個氨基酸突變后導致病毒顆粒中L2蛋白完全消失,但在細胞中L2蛋白表達量同野生型相近;L2-D329A突變假病毒中L2蛋白有所變化但變化不明顯,而L2蛋白的免疫反應性降低,說明329位點的突變導致顆粒組裝過程中L2蛋白的構象發(fā)生改變;進而證明次要結構蛋白L2中D337、D338、D340和D329突變后導致組裝入顆粒中的L2蛋白減少或者L2蛋白構象發(fā)生改變。同樣,免疫熒光實驗分析突變假病毒感染過程發(fā)現(xiàn),突變假病毒顆粒中L2蛋白的消失使得L2-D337A-D338A-D340A假病毒喪失入胞能力,但不干擾它吸附細胞外基質(zhì)與細胞膜,而L2-D329A突變假病毒則可正常入胞,而其感染能力顯著下降,說明該位點可能與病毒入胞后的后續(xù)感染過程有關�；谏鲜鲅芯揩@得的L1和L2蛋白相互作用的關鍵位點,嘗試在病毒顆粒內(nèi)部引入二硫鍵,鎖定結構蛋白L1和L2的相互作用,為解析L2三維結構奠定基礎。將L1和L2蛋白相互作用的關鍵氨基酸突變?yōu)榘腚装彼岵⑾嗷ヅ鋵χ苽浼俨《绢w粒,利用還原和非還原Western blotting分析發(fā)現(xiàn)L1-Q317C與L2-D329C配對的假病毒可形成大小約為180kD的蛋白條帶,表明這兩個氨基酸在病毒顆粒中成功交聯(lián)形成二硫鍵,雙抗夾心檢測發(fā)現(xiàn)L2蛋白的免疫反應性有所下降,表明16L1-Q317C+L2-D329C假病毒中二硫鍵的引入引起L2蛋白的構象發(fā)生變化,可能導致L2N端第21-30位氨基酸的暴露發(fā)生改變,且感染率分析結果表明其感染能力顯著下降;利用免疫熒光進一步分析16L1-Q317C+L2-D329C假病毒的初期感染過程的變化,發(fā)現(xiàn)突變假病毒均能正常吸附細胞外基質(zhì)與細胞膜,并能正常入胞,表明二硫鍵的引入不影響假病毒吸附細胞。綜上所述,本研究進一步研究了 L1蛋白中參與衣殼蛋白相互作用的四個關鍵氨基酸的性質(zhì)和功能,首次鑒定了次要結構蛋白L2中與L1蛋白相互作用的關鍵位點,并分析了關鍵位點在病毒顆粒組裝和感染中的作用,基于L1和L2相互作用關鍵位點成功地在病毒衣殼內(nèi)部引入二硫鍵,為解析高分辨率的L2蛋白結構、闡明HPV組裝和感染機制奠定基礎,同時為HPV廣譜疫苗或治療藥物的設計提供結構和功能信息。
【圖文】：

ＨＰＶ是乳頭瘤病毒科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）乳頭瘤病毒屬，無包膜的ＤＮＡ病逡逑毒，結構相對簡單，由病毒衣殼蛋白和病毒基因組ＤＮＡ構成，其基因組長約７．２－逡逑８ｋｂ，結構如圖１．１所示，按照功能的不同主要分為三個部分：早期區(qū)（ｅａｒｉｙｒｅｇｉｏｎ，逡逑ＥＲ），約占４ｋｂ，主要編碼非結構蛋白即早期蛋白Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４－Ｅ７，與病毒的復逡逑制、轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)化密切相關；晚期區(qū)（ｌａｔｅｒｅｇｉｏｎ，ＬＲ），大小約為３ｋｂ，編碼主要逡逑結構蛋白Ｌ１和次要結構蛋白Ｌ２，只在增殖性感染的細胞中表達：非編碼區(qū)即長逡逑調(diào)控區(qū)（ｌｏｎｇｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ，ＬＣＲ），位于早期區(qū)和晚期區(qū)之間，包含有重要的轉(zhuǎn)逡逑錄調(diào)控原件和ＤＮＡ復制的起始位點。編碼區(qū)ＤＮＡ含有８到９個開放閱讀框逡逑（ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ〉，編碼早期蛋白和晚期蛋白，所有的ＯＲＦ均位于同逡逑１逡逑

ｔｈｅ邋ｅａｒｌｙ邋ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ；邋ＰＡＬ：邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌａｔｅ邋ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ；邋ＰＥ：逡逑Ｅａｒｌｙ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ，邋ａｌｓｏ邋ｒｅｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ａｓ邋ｐ９７；邋ＰＬ：邋ｌａｔｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ．逡逑ＨＰＶ的生活周期如圖１．２所示：病毒在進入宿主細胞后，在細胞內(nèi)細胞因子逡逑的啟動下啟動早期蛋白Ｅｌ、Ｅ２的表達，促使病毒ＤＮＡ利用宿主細胞的復制系逡逑統(tǒng)進行基因組的復制。而早期蛋白Ｅ５、Ｅ６和Ｅ７則將激活成熟的、處于非復制逡逑周期的角質(zhì)細胞，啟動其分裂增生，促使病毒基因組持續(xù)復制和表達。為使攜帶逡逑有病毒ＤＮＡ的角質(zhì)細胞遷移至上皮組織表層，被感染的上皮細胞不斷地進行復逡逑制，因此ＨＰＶ早期蛋白Ｅ５、Ｅ６和Ｅ７的表達被上調(diào)，致使大量的Ｅ６、Ｅ７被表逡逑達，宿主細胞則因而脫離正常的細胞周期軌道。Ｅ４蛋白開始表達，并且啟動晚逡逑期蛋白Ｌ１和Ｌ２的表達，，晚期蛋白在Ｅ４蛋白的協(xié)助下包裹病毒基因組形成新的逡逑病毒顆粒。而成熟的ＨＰＶ病毒從上皮細胞釋放，細胞脫落，ＨＰＶ的生活史完成逡逑［７
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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