【摘要】：狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一種古老的急性、高致死性人獸共患病。全球平均每年仍有大約55,000人死于狂犬病,我國是狂犬病的高發(fā)區(qū)�？袢〔《緦儆趶棤畈《究瓶袢〔《緦俪蓡T,具有強烈的嗜神經(jīng)性,一旦發(fā)病病死率幾乎為100%。疫苗免疫是目前防治狂犬病最為有效的方法。但目前的疫苗存在免疫程序復雜、免疫后抗體產(chǎn)生遲緩,抗體維持時間短等缺點,亟待研制新型狂犬病疫苗。9型腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus type 9,AAV9)為細小病毒家族依賴病毒屬的缺陷型病毒,其作為基因工程疫苗載體具有安全性高、可持續(xù)表達外源基因等優(yōu)點,具有極低的免疫原性和毒性的同時,穿透血腦屏障的能力較強。本研究將狂犬病病毒主要保護性抗原G蛋白基因重組至9型腺相關(guān)病毒,獲得重組腺相關(guān)病毒rAAV9-GFP-RABVG。通過體外細胞實驗、動物免疫及攻毒保護實驗,分析G蛋白表達情況,評價其免疫原性和保護性。目的1.采用9型腺相關(guān)病毒作為載體,插入狂犬病病毒SRV9毒株G蛋白基因,構(gòu)建表達狂犬病病毒G蛋白的重組腺相關(guān)病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.通過體外細胞實驗檢測rAAV9-GFP-RABVG在細胞水平上能否表達RABV G蛋白;通過動物免疫實驗檢測rAAV9-GFP-RABVG的免疫原性和保護性,為新型重組狂犬病疫苗的研制提供科學依據(jù)。方法1.構(gòu)建表達狂犬病病毒G蛋白的9型腺相關(guān)病毒載體重組病毒rAAV9-GFP-RABVG,體外感染293T細胞,通過間接免疫熒光實驗和Western blot檢測狂犬病病毒G蛋白的表達情況。2.6-8周齡雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,監(jiān)測小鼠體重、飲食、毛色狀態(tài),持續(xù)21天,通過小鼠體重變化及小鼠狀態(tài)初步評價重組病毒疫苗的安全性。3.6-8周齡雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,在免疫后第2、4、8、12、24周采血,分離外周血清,利用熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢測病毒中和抗體(VNA)效價,獲得中和抗體的持續(xù)期和消長變化規(guī)律。4.通過流式細胞術(shù)檢測rAAV9-GFP-RABVG誘導小鼠募集和/或活化B、T、DCs細胞的情況。5.使用ELISpot檢測試劑盒檢測特異性刺激物存在時rAAV9-GFP-RABVG誘導小鼠脾細胞分泌細胞因子IFN-y和IL-4的能力。6.使用ELISA試劑盒檢測特異性刺激物存在時rAAV9-GFP-RABVG誘導小鼠脾細胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平。7.攻毒保護實驗。6-8周齡雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG后21天,異側(cè)后肢骨骼肌注射HuPBN3株狂犬病病毒,記錄攻毒后21天內(nèi)小鼠狀態(tài)及死亡情況,取死亡小鼠腦組織進行RT-PCR,檢測rAAV9-GFP-RABVG能否保護小鼠免于狂犬病病毒致死劑量的攻擊。結(jié)果1.間接免疫熒光及Western blot實驗檢測到狂犬病病毒G蛋白在細胞水平上的表達,且分子量約為70kD,與預(yù)期大小相符。2.與空白組和AAV9-GFP對照組相比,rAAV9-GFP-RABVG重組病毒組小鼠體重變化輕微,未出現(xiàn)異常行為或神經(jīng)癥狀。3.對免疫小鼠血清中和抗體水平檢測結(jié)果顯示,與對照組AAV9-GFP相比,rAAV9-GFP-RABVG能誘導小鼠產(chǎn)生強烈的RABV中和抗體,免疫后2周達到13.66IU/ml,第8周達到峰值,且免疫后24周仍保持較高水平。4.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與空白組和AAV9-GFP對照組相比,rAAV9-GFP-RABVG能誘導小鼠募集和/活化更多的B細胞(CD19+CD40+雙陽性)和DCs(CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC Ⅱ+雙陽性)細胞,小鼠脾中抗原特異性分泌IFN-γ和IL-4的CD4+T細胞和抗原特異性分泌IFN-γ的CD88+細胞顯著增多。5.IFN-γ ELISpot和IL-4 ELISpot檢測結(jié)果趨勢相似,與空白組和AAV9-GFP對照組相比,rAAV9-GFP-RABVG刺激小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生的斑點形成細胞(SFCs)數(shù)目顯著增多。6.ElISA結(jié)果顯示,與空白組和AAV9-GFP對照組相比,rAAV9-GFP-RABVG誘導小鼠脾細胞抗原特異性分泌的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ顯著增多。7.攻毒保護實驗結(jié)果顯示,攻毒后觀察期結(jié)束時空白組及AAV-GFP對照組的小鼠出現(xiàn)典型狂犬病癥狀,且存活率均為0%。rAAV9-GFP-RABVG重組病毒組小鼠觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何狂犬病癥狀,觀察期結(jié)束時組內(nèi)小鼠存活率為100%�？瞻捉M和AAV9-GFP對照組死亡小鼠腦組織的RT-PCR結(jié)果顯示,死亡小鼠死于狂犬病。結(jié)論1.成功構(gòu)建了表達狂犬病病毒G蛋白的重組腺相關(guān)病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.rAAV9-GFP-RABVG在小鼠體內(nèi)可觸發(fā)針對狂犬病病毒的特異性免疫應(yīng)答,誘導產(chǎn)生強烈的體液和細胞免疫反應(yīng),為小鼠提供了完全保護力抵抗狂犬病病毒致死性的攻擊,證明該重組病毒具有新型狂犬病候選疫苗的潛力。
【圖文】：

圖１邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ質(zhì)粒構(gòu)建圖逡逑將目的基因ＲＡＢＶＧ插入到Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏ的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒載體ｐＡＶ－ＣＭＶ－逡逑Ｐ２Ａ－ＧＦＰ邋ＡＡＶ的兩個酶切位點Ｉ和Ｍ／ｗ邋Ｉ之間（圖１），進行重組病毒質(zhì)逡逑粒的構(gòu)建克隆。逡逑２．邐ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ目的基因鑒定：逡逑（１）雙酶切反應(yīng)體系：逡逑重組質(zhì)粒逡逑Ａｓｉｓ邋Ｉ邐ｌ＾ｉｌ逡逑２９逡逑

、ＲＡＢＶＧ基因在重組腺相關(guān)病毒感染性克隆質(zhì)粒的檢測逡逑將構(gòu)建的重組感染性克隆質(zhì)粒ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ用Ａｙｋ邋Ｉ和Ｍｗ邋Ｉ內(nèi)切逡逑酶進行雙酶切鑒定。雙酶切結(jié)果如圖３所示，在５，３５０ｂｐ和ｌ，５７５ｂｐ處有兩條明逡逑顯條帶，上方一條為ｐＡＶ－ＣＭＶ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ邋（５，３５０ｂｐ），下方一條為插入ＳＲＶ９－逡逑Ｇ片段（ｌ，５７５ｂｐ），與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果證實為ＳＲＶ９－Ｇ，證明成功構(gòu)逡逑建表達ＲＡＢＶ－Ｇ基因的ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ感染性克隆質(zhì)粒。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１逡逑１００００逡逑７０００逡逑４０００邋Ｐ＞＾ａ－５３５0ｂＰ逡逑２０００逡逑Ｓｊｊ＾ａ？．邐１５７５ｂｐ逡逑１０００逡逑ｍＭ逡逑２５°ＤＩ逡逑圖３邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ質(zhì)粒的雙酶切鑒走逡逑Ｍ：邋ＤＬ１００００邋ＤＭＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ邋質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)物。逡逑二、ＧＦＰ蛋白及ＲＡＢＶＧ蛋白表達檢測逡逑１．邐ＧＦＰ蛋白熒光觀察結(jié)果：將ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ病毒（滴度：２．０ｘｌ０ｌ３ｖ．ｇ．／ｍｌ），逡逑ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ邋重組病毒（滴度：２．0ｘｌ0ｌ３ｖ．ｇ．／ｍｌ）接種邋２９３Ｔ邋細胞，逡逑空白組不接種病毒，７２ｈ后直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在逡逑ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ病毒和ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ重組病毒感染的２９３Ｔ細胞中觀察逡逑到明顯的熒光，ＧＦＰ蛋白表達較強，空白組未觀察到熒光（圖４）。逡逑２．
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

【參考文獻】

相關(guān)會議論文 前2條

1 殷文武;;我國狂犬病消除進展及展望[A];2017中國狂犬病年會論文集[C];2017年

2 鄭新雄;徐葛林;祝玉桃;嚴家新;陳偉;趙德鋒;;國產(chǎn)和進口人用無佐劑狂犬病疫苗的免疫效果研究[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學術(shù)研討會論文集[C];2011年

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本文編號：2680036