【摘要】：目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有多向分化潛能的細胞,可在體外長時間保持未分化狀態(tài),增殖能力強,易于在體外大量培養(yǎng),可以特異遷移到損傷部位及腫瘤局部,向骨組織,心肌,軟骨組織,肌肉組織等分化,對心肌梗死,腦梗死,急慢性肝功能衰竭等具有一定的治療作用,顯示了其強大的應(yīng)用前景。然而,盡管骨髓中MSCs含量相對較多,但仍難以滿足細胞治療的需要,故常需要在體外進行培養(yǎng)擴增才能滿足要求。已有研究顯示,MSCs移植后在體內(nèi)的歸巢能力,會隨著供體細胞在體外的培養(yǎng)傳代而下降。歸巢能力的下降又會進一步影響到MSCs在靶向組織中的植入,從而嚴重影響了MSCs對靶組織的修復(fù)作用。因此,提高MSCs向靶向組織的特異性歸巢,是提高干細胞移植療效的關(guān)鍵。MSCs表面可檢測到CXCR4,CXCR6, CXCL12(SDF-1),CD44等細胞因子的表達,其中CXCR4/SDF-1軸的作用已被證實在MSCs的歸巢中起到重要作用。 本實驗旨在通過體外分離培養(yǎng)健康人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞,觀察不同代次細胞的生長特點；分析不同代次細胞CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44表達的差異,初步探究體外擴增傳代對MSCs歸巢能力影響的機制。 方法：應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法將MSCs目骨髓中分離出來,利用其貼壁生長的特性加以純化,在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第7代,觀察原代及第3、5、7代細胞的形態(tài)學(xué)特點。采用MTT法檢測第3、5、7代MSCs的生長增殖特性,并繪制生長曲線。Real-time PCR法檢測第3、5、7代MSCs中CXCR4,CXCR6, CXCL12,CD44的表達,記錄每個樣品的目的基因和內(nèi)參β-actin的Ct值,計算相應(yīng)的△Ct(△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因),以及△△Ct(△△Ct=△Cta一△Ctb),最后計算2-△△Ct得到各代細胞目的基因的相對表達率,即不同代次MSCs中各細胞因子表達的差異倍數(shù)。所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件進行分析。采用配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析,p0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：MSCs原代細胞呈長梭形,細胞形態(tài)均一,擴增速度快,克隆形成能力強,體外培養(yǎng)1至2周可傳代。傳代后細胞生長速度明顯加快,24小時內(nèi)完全貼壁、伸展,重新變?yōu)殚L梭形,生長潛伏期較短(1-2天),培養(yǎng)4-7天即達到完全融合。骨髓間充質(zhì)干細胞在體外的增殖能力較強,但隨著傳代擴增次數(shù)增加,其形態(tài)從細長梭形逐漸縮短變寬,增殖速率及總體擴增倍數(shù)亦隨傳代呈下降趨勢。MSCs表達CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44,但其表達量隨傳代而下降。對于CXCR4而言,第5代MSCs的表達為第3代的53.18%,而第7代的表達僅為第3代的27.04%,且第3、5、7代MSCs中CXCR4的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。對于CXCL12而言,第5代MSCs的表達為第3代的56.59%,而第7代的表達量僅為第3代的27.41%,且第3、5、7代MSCs中CXCL12的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。對于CXCR6,第5代MSCs中的表達為第3代的76.37%,第7代的表達為第3代的42.12%,其中第3代與第7代,第5代與第7代MSCs中CXCR6的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第5代相比第3代MSCs中CXCR6的表達具有下降趨勢,增大樣本量可能獲得統(tǒng)計學(xué)意義。對于CD44,第5代MSCs中的表達為第3代的53.99%,第7代的表達僅為為第3代的23.56%。其中第3代與第5代,第3代與第7代MSCs中CD44的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第7代相比第5代MSCs中CD44的表達下降趨勢明顯,增大樣本量可能獲得統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：體外培養(yǎng)可獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細胞,易于培養(yǎng)擴增,在體外的增殖能力較強,但增殖速率及總體擴增倍數(shù)隨傳代下降。其歸巢相關(guān)因子的表達亦隨傳代培養(yǎng)而下降,提示間充質(zhì)干細胞的歸巢能力隨擴增傳代下降可能與CXCR4,CXCR6,CXCL12(SDF-1),CD44等歸巢相關(guān)因子在MSCs中的表達水平下降相關(guān)。
【圖文】：

5rnlFicoll分離液上（下層為Ficoll細胞分離液，上層為骨髓標本，兩者勿混合）。(5)常溫下，，以2200r/min離心25分鐘，離心管中形成密度梯度（圖1)。(6)取界面層細胞，轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，加入lOmlPBS，吹打混勻后，常溫1500r/min離心5分鐘，棄上清。(7)再次加入lOmlPBS,吹打混勻后，常溫1500r/min離心5分鐘，棄上清。(8)以DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%雙抗）重懸細胞

(3)計數(shù)將計數(shù)板放在低倍鏡下（10X10倍）觀察計數(shù)。按圖2計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計上線細胞不計下線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復(fù)計數(shù)誤差不應(yīng)超過+5%。(4)計數(shù)的換算計數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為9
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2675229