發(fā)布時間：2020-05-09 15:53

【摘要】：結膜吸吮線蟲,可寄生于家畜、野生食肉動物及人的結膜囊內,導致結膜吸吮線蟲病,主要表現為結膜炎,結膜充血,淚腺分泌物增加,嚴重者可出現角膜潰瘍,甚至失明。1910年在印度犬的結膜囊內首次發(fā)現結膜吸吮線蟲,1917年在我國的北京和福州首次發(fā)現人感染病例。目前,世界多地均有結膜吸吮線蟲病的報道,但大多數病例出現在亞洲的東部和東南部地區(qū),因此結膜吸吮線蟲又稱為東方眼蟲。我國是結膜吸吮線蟲感染病例最多的國家,已有超過600例病例報道。近年來,結膜吸吮線蟲病發(fā)病數在我國部分地區(qū)呈上升趨勢,已經成為新現的動物源性寄生蟲病。盡管我國多地存在結膜吸吮線蟲病的威脅,但有關結膜吸吮線蟲的系統(tǒng)性鑒定及遺傳多態(tài)性研究仍比較薄弱,本研究首先對我國3例結膜吸吮線蟲臨床分離株進行形態(tài)學鑒定,并對其線粒體基因組進行重測序,然后對我國11個地區(qū)的蟲體分離株進行遺傳多態(tài)性分析,為結膜吸吮線蟲病的預防及控制策略奠定基礎。材料與方法1結膜吸吮線蟲的鑒定:分別使用光學顯微鏡和掃描電鏡對我國中部地區(qū)的三條結膜吸吮線蟲臨床分離株進行觀察,并對關鍵形態(tài)部位進行拍照、描述和記錄,根據分類檢索表,對其進行物種鑒定。2線粒體基因組的測序及組裝:使用長PCR擴增法對結膜吸吮線蟲的線粒體基因組進行擴增,在Illumina HiSeq 2000平臺上進行高通量測序。然后使用FastQC v.0.11.5軟件對原始的測序讀長進行質量評價,接著使用CLC Genomic Workbench v.7.0.4軟件將這些修飾過的序列標注到結膜吸吮線蟲兩個參考線粒體組(NC_018363和AP017700)序列上。最后,使用MITOS對線粒體基因進行注釋,并提交至GenBnak數據庫。3結膜吸吮線蟲種群的遺傳多態(tài)性分析:選用五個分子標記:cytb、cox1、12S rDNA、ITS1和18S rDNA對結膜吸吮線蟲的遺傳多樣性進行分析。使用DnaSP v5.10軟件估算每個分子標記的單倍型數量、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)。單倍型之間的中介連接網絡關系使用Network v5.0軟件進行繪制。種群之間的遺傳差異性水平用F_(ST)值進行評估。使用Arlequin程序中的岐點分布分析來估計結膜吸吮線蟲種群結構變化。同樣使用Arlequin程序中的Tajima’s D檢驗和Fu’s F_S檢驗推斷種群是否發(fā)生過種群擴張。此外,基于cox1序列比較全球不同地區(qū)不同宿主結膜吸吮線蟲分離株間的遺傳差異。4系統(tǒng)發(fā)育分析:分別用最大簡約法(MP)和貝葉斯法(BI)進行結膜吸吮線蟲cox1單倍型的系統(tǒng)發(fā)育模式分析。MP分析在PAUP*4b10中進行,BI分析在MrBayes v3.2中進行。結果1結膜吸吮線蟲形態(tài)特征:觀察到雌蟲的主要特征有:結膜吸吮線蟲特有的口囊特征;在蟲體后半部,子宮內中充滿未成熟的卵和生殖細胞;蟲體前部橫向條紋的角質層比尾端更明顯;包含短瓣結構的陰門位于蟲體的前部。雄蟲的主要特征有:和雌蟲相比,雄蟲的口囊不明顯,口腔張開時呈圓形或橢圓形,雄蟲有兩個不同的交合刺,左邊的較長,右邊較短呈典型的月牙型,蟲體尾端彎曲,雄蟲尾部有5對乳狀突起。2結膜吸吮線蟲線粒體組的特征及比較:結膜吸吮線蟲線粒體基因組具有12個PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及蛋白基因編碼方向與長度均相同。在線粒體基因中,一些基因存在重疊區(qū)域。22個tRNA基因長度范圍在53到66個堿基之間。在cox3和丙氨酸(trnA)基因之間,存在一段較長(316 bp)的非編碼區(qū)。來自不同地區(qū)的結膜吸吮線蟲線粒體基因組序列的相似性為98.22%。蛋白編碼基因序列之間相似性最高的是nad4L,最低的是atp6。氨基酸序列相似性最高的為cox1,最低的是nad6。線粒體核糖體大小亞基rDNA的序列相似性分別為89.95%和96.71%。3結膜吸吮線蟲分離株的多態(tài)性及遺傳差異比較:我國11個地區(qū)的32個結膜吸吮線蟲臨床分離株中具有較高的遺傳多態(tài)性。全球不同地區(qū)的cox1基因共鑒定出21個單倍型,歐洲國家的結膜吸吮線蟲均為Hap1,結膜吸吮線蟲Haps2 8和haps10 12主要存在于犬分離株中。Hap9和haps13 21主要存在于臨床分離株中。21個單倍型的比對發(fā)現37處核苷酸變異。種群差異性分析結果顯示,歐洲和亞洲國家種群的差別大于中國,韓國,日本種群間的差別。中性檢測及岐點分布分析結果均不支持結膜吸吮線蟲種群存在擴張效應。4系統(tǒng)發(fā)育重建:在旋尾目線蟲中,顎體科與龍線科+嗜子宮科+泡翼科+吸吮科+筒線科+絲狀科+盤尾絲蟲科組成的分枝是姊妹類群。在較大的分枝中,最早分化出來的是龍線蟲科和嗜子宮科。盤尾絲蟲科作為一個單系分支,是最晚分化出來的。來自歐洲和亞洲國家的結膜吸吮線蟲種群被分成兩個亞群,這兩個種群在更新世中期開始分化。結論1基于光鏡和電鏡的形態(tài)特征,所有的臨床分離株均被鑒定為結膜吸吮線蟲。2在結膜吸吮線蟲線粒體基因中,nad6基因顯示出較高的序列變異,可作為結膜吸吮線蟲種群遺傳學研究的靶基因。3在cox1序列中有5個核苷酸位點可以將結膜吸吮線蟲歐洲和亞洲分離株進行區(qū)分。歐洲和亞洲種群的遺傳差異要大于中國,韓國,日本等亞洲國家種群之間的差別。4歐洲和亞洲的結膜吸吮線蟲種群可以分為兩個亞群,且這兩個亞群在更新世中期開始分化。5系統(tǒng)發(fā)育分析顯示吸吮科、盤尾絲蟲科、絲狀科、筒線科、泡翼科、龍線科和嗜子宮科的親緣關系較近。
【圖文】：

圖 4.1 結膜吸吮線蟲蟲體局部特征注釋：Fa：雌蟲口囊；Fb：子宮后半段未成熟卵或生殖細胞；Fc 和 Fd：尾感器和肛Fe：表皮角質層；Ff：雌蟲陰門；Ma：雄蟲口囊；Mc:雄蟲交合刺；Md：雄蟲圓形圓形的口囊；Me：雄蟲交合刺；Mf：雄蟲尾端五對尾感器。4.3 線粒體組的特征及比較結膜吸吮線蟲分離株HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1分別有961 424，961 094和104個序列讀長及162 140 093，166 174 524和162 301 339個堿基被回帖到線粒體基上，詳細信息見表4.1。表 4.1 Illumina 測序結膜吸吮線蟲線粒體基因組的組裝和序列統(tǒng)計樣本線粒體基因長度(bp)序列 長度*(bp) 堿基 Q20(%) GC(%)N#(ppm)HeN-LY1 13668 961424 168.65 162140093 97.41 26.41 19.03HeN-PDS1 13667 961094 172.90 166174524 97.63 26.97 16.01HeN-ZZ1 13668 970104 168.72 162301339 97.69 25.36 18.59*讀取的平均長度；#每百萬分之一堿基；Q20 表示誤差概率為 1%。分別對三個新的線粒體基因組序列進行了注釋，每個線粒體基因組都具有PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及編碼方向均相同，

分別對三個新的線粒體基因組序列進行了注釋，每個線粒體基因組都具有12個PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及編碼方向均相同，并且HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1三個線粒體組的蛋白編碼基因的長度均相同(圖4.2 )。圖 4.2 結膜吸吮線蟲線粒體基因注釋在線粒體基因中，，一些基因存在重疊區(qū)域，如：nad6/trnR，有9 bp序列重合，rnL1/cox3(3 bp)，trnL2/trnN (11 bp)，nad1/trnF (32 bp)，cox2/trnH (10 bp)，rrnL/nad3 (8 bp)
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R383.1

【參考文獻】

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1 王增賢;沈繼龍;杜繼雙;江寶玲;韓錫鵬;王志成;;換代犬與阻斷結膜吸吮線蟲病流行關系的研究[J];熱帶病與寄生蟲學;2003年04期

2 王增賢,陳群,江寶玲,王志成,沈繼龍;中國結膜吸吮線蟲及結膜吸吮線蟲病流行病學[J];疾病控制雜志;2002年04期

本文編號：2656380